Avaliação de métodos de rompimento celular e de diferentes metais imobilizados em resina Streamline Chelating para purificação do antígeno 503 de Leishmania i. chagasi
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Data de Publicação: | 2017 |
Tipo de documento: | Dissertação |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Repositório Institucional da UFRN |
Texto Completo: | https://repositorio.ufrn.br/jspui/handle/123456789/23391 |
Resumo: | Com o desenvolvimento da indústria biotecnológica, é crescente o interesse por antígenos recombinantes purificados para obtenção de vacinas. Porém, para essa aplicação esses antígenos precisam apresentar um elevado grau de pureza, e por isso é de grande relevância o desenvolvimento de técnicas que permitam a redução do número de operações unitárias necessárias ao processo de purificação, permitindo ainda uma elevada recuperação e proporcionando uma maior economia na obtenção dos bioprodutos. A Adsorção em Leito Expandido (ALE) vem se destacando como uma alternativa propícia para o downstream processing, pois é uma técnica cromatográfica de modo simples e de baixo custo, que integra as etapas de clarificação, concentração, purificação em uma única operação. Neste contexto, o presente trabalho tem como objetivo avaliar os métodos de rompimento celular e os diferentes metais imobilizados em resina Streamline chelating para purificação do antígeno 503 de Leishmania i. chagasi por ALE bem como remover os lipopolissacarídeos (LPS) liberados durante a etapa de rompimento celular. Primeiramente, foi avaliado qual o melhor método de rompimento celular para obtenção da proteína intracelular. As estratégias estudadas utilizando lisozima, pérolas de vidro, ureia e EDTA foram avaliadas através de quatro planejamentos experimentais. Em seguida, foram realizados testes de adsorção em batelada, utilizando-se cinco íons metálicos (Cu2+, Ni2+, Zn2+, Co2+ e Fe3+) nas concentrações de 0,1, 0,5 e 0,8 mol/L acoplados na resina Streamline chelating, escolhendo-se o metal que apresentou melhor adsorção do antígeno para os ensaios usando ALE. Posteriormente, foi estimada a quantidade mínima de tensoativo Triton X-114 necessária na etapa de lavagem da ALE para remoção do LPS, a fim de obter-se o antígeno 503 livre desse contaminante. E por fim, foram realizados ensaios de ALE visando recuperar e purificar a proteína de interesse. Para os ensaios usando ALE utilizou-se uma coluna de 2,6 cm de diâmetro por 30 cm de altura, acoplada a uma bomba peristáltica. Com os planejamentos experimentais realizados para avaliação do rompimento celular, observou-se que maiores quantidades de proteínas totais e do antígeno 503 liberadas foram obtidas para o método da ureia e que o único fator significativo para esse planejamento foi a concentração, correspondente a 8,0 M. Como resultado para a triagem do íon metálico, o cobre (Cu2+) foi o metal que apresentou maior capacidade de adsorção do antígeno 503, apresentando valores de capacidade de adsorção de 0,102, 0,128 e 0,111 mg/mL de adsorvente para as concentrações de 0,1, 0,5 e 0,8 mol/L, respectivamente. Tem-se ainda que para as três condições analisadas (0,01, 0,05 e 0,1 % de Triton X-114) na etapa de lavagem da ALE o percentual de remoção de LPS foi elevado e que a concentração mínima utilizada (0,01 %) já foi suficiente para a remoção de 99,70 % deste contaminante. Para o teste de ALE utilizando eluição isocrática (0,6 M de imidazol) os resultados obtidos mostraram baixa recuperação (3,0 %) do antígeno 503. Avaliou-se então a eluição em degrau, inicialmente em dois passos, aplicando-se 0,6 mol/L e, em seguida, 1,0 mol/L de imidazol. Porém, esta estratégia ainda não foi eficiente para recuperar a proteína de interesse. Um novo ensaio foi realizado, com um total de três passos de eluição, utilizando 0,3 e 0,6 mol/L. Esse último teste mostrou uma recuperação de 15,0 % da proteína de interesse e um fator de purificação de, aproximadamente, 3,0. Portanto, a técnica cromatográfica de afinidade por íons metálicos imobilizados (IMAC) mostrou ser uma alternativa eficiente na recuperação e purificação do antígeno 503 a partir do homogeneizado de E. coli não clarificado. |
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Porém, para essa aplicação esses antígenos precisam apresentar um elevado grau de pureza, e por isso é de grande relevância o desenvolvimento de técnicas que permitam a redução do número de operações unitárias necessárias ao processo de purificação, permitindo ainda uma elevada recuperação e proporcionando uma maior economia na obtenção dos bioprodutos. A Adsorção em Leito Expandido (ALE) vem se destacando como uma alternativa propícia para o downstream processing, pois é uma técnica cromatográfica de modo simples e de baixo custo, que integra as etapas de clarificação, concentração, purificação em uma única operação. Neste contexto, o presente trabalho tem como objetivo avaliar os métodos de rompimento celular e os diferentes metais imobilizados em resina Streamline chelating para purificação do antígeno 503 de Leishmania i. chagasi por ALE bem como remover os lipopolissacarídeos (LPS) liberados durante a etapa de rompimento celular. 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Para o teste de ALE utilizando eluição isocrática (0,6 M de imidazol) os resultados obtidos mostraram baixa recuperação (3,0 %) do antígeno 503. Avaliou-se então a eluição em degrau, inicialmente em dois passos, aplicando-se 0,6 mol/L e, em seguida, 1,0 mol/L de imidazol. Porém, esta estratégia ainda não foi eficiente para recuperar a proteína de interesse. Um novo ensaio foi realizado, com um total de três passos de eluição, utilizando 0,3 e 0,6 mol/L. Esse último teste mostrou uma recuperação de 15,0 % da proteína de interesse e um fator de purificação de, aproximadamente, 3,0. Portanto, a técnica cromatográfica de afinidade por íons metálicos imobilizados (IMAC) mostrou ser uma alternativa eficiente na recuperação e purificação do antígeno 503 a partir do homogeneizado de E. coli não clarificado.Due to the development of biotechnology industry, there is a growing interest in purified recombinant antigens to obtain vaccines. However, for this application these antigens require a high degree of purity, thus, it is of great relevance the development of techniques that allow the reduction in the number of unitary operations required for the purification process, this would also allow a high recovery and a greater saving in obtaining bioproducts. The Expanded Bed Adsorption (EBA) has shown as a suitable alternative for downstream processing, once it is a simple and low cost chromatographic technique that integrates clarification, concentration and purification in a single operation. This study aims at evaluating the methods of cell disruption and the different metals immobilized in Streamline Chelating resin for purification of Leishmania i. chagasi 503 antigen by EBA as well as removing the lipopolysaccharides (endotoxin) released during the stage of cell disruption. Firstly, the best method of cell disruption to obtain intracellular protein was evaluated. The strategies studied using lysozyme, glass beads, urea and EDTA were evaluated through four experimental designs. Then, batch adsorption tests were carried out using five metal ions (Cu2+, Ni2+, Zn2+, Co2+ and Fe3+) at concentrations of 0.1, 0.5 and 0.8 M coupled in the Streamline chelating resin, selecting the metal that showed the best adsorption of the antigen for the assays using EBA. Then, the minimum amount of Triton X-114 tensioactive required in the EBA wash stage for LPS removal was estimated in order to obtain the 503 antigen free of this contaminant. Finally, EBA assays were performed in order to recover and purify the protein of interest. EBA experiments were carried out using a column of 2.6 cm in diameter (30 cm height), coupled to a peristaltic pump. The experimental plannings carried out to evaluate cell disruption, showed that higher amounts of total proteins and 503 antigen released were obtained for the urea method and that the only significant factor for this planning was the concentration corresponding to 8.0 M. As a result of the metal ion screening, copper (Cu2+) was the metal with the highest adsorption capacity of 503 antigen, presenting adsorption capacity values of 0.102, 0.128 and 0.111 mg / mL of adsorbent at concentrations of 0.1, 0.5 and 0.8 M, respectively. For the three analyzed conditions (0.01, 0.05 and 0.1% Triton X-114) in the EBA washing stage, the percentage of LPS removal was high and the minimum concentration used (0.01%) was enough to remove 99.70% of this contaminant. For the EBA test using isocratic elution (0.6 M imidazole) the results obtained showed a low recovery (3.0 %) of the 503 antigen. The step elution was then evaluated, initially in two steps, applying 0.6 M and then 1.0 M imidazole. However, this strategy has not yet been effective in recovering the protein of interest. A new assay was performed, with a total of three elution steps, using 0.3 and 0.6 M. This test showed that a recovery of 15.0% of the protein of interest and a purification factor of 3.0. Therefore, the immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) technique has been shown to be an efficient alternative in the recovery and purification of the 503 antigen from the homogenized E. coli unclarified.porCNPQ::CIENCIAS EXATAS E DA TERRA::QUIMICAAdsorção em leito expandidoPurificaçãoÍon metálicoAntígeno 503Remoção de LPSAvaliação de métodos de rompimento celular e de diferentes metais imobilizados em resina Streamline Chelating para purificação do antígeno 503 de Leishmania i. chagasiinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisPROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICAUFRNBrasilinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da UFRNinstname:Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN)instacron:UFRNORIGINALAnaLauraOliveiraDeSaLeitao_DISSERT.pdfAnaLauraOliveiraDeSaLeitao_DISSERT.pdfapplication/pdf2560034https://repositorio.ufrn.br/bitstream/123456789/23391/1/AnaLauraOliveiraDeSaLeitao_DISSERT.pdfe03864d56ee5d2dbee62243d1d3e4b3dMD51TEXTAnaLauraOliveiraDeSaLeitao_DISSERT.pdf.txtAnaLauraOliveiraDeSaLeitao_DISSERT.pdf.txtExtracted texttext/plain169940https://repositorio.ufrn.br/bitstream/123456789/23391/4/AnaLauraOliveiraDeSaLeitao_DISSERT.pdf.txt41edbe029623837b4e4d109718e2c19dMD54THUMBNAILAnaLauraOliveiraDeSaLeitao_DISSERT.pdf.jpgAnaLauraOliveiraDeSaLeitao_DISSERT.pdf.jpgIM Thumbnailimage/jpeg3155https://repositorio.ufrn.br/bitstream/123456789/23391/5/AnaLauraOliveiraDeSaLeitao_DISSERT.pdf.jpgebfd60769cc4267c4edc8284e22cfaaaMD55123456789/233912017-11-04 18:50:40.953oai:https://repositorio.ufrn.br:123456789/23391Repositório de PublicaçõesPUBhttp://repositorio.ufrn.br/oai/opendoar:2017-11-04T21:50:40Repositório Institucional da UFRN - Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN)false |
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