Aplicação da citometria de fluxo no estudo da resposta imune de pacientes com Leishmaniose tegumentar americana

• Autor(a) principal: Pereira, Allana Maria de Souza
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Trabalho de conclusão de curso
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório institucional da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE) (RI-UFRPE)
• Texto Completo: https://repository.ufrpe.br/handle/123456789/884
• topic: Diagnóstico; Imunologia; Leishmania braziliensis

A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é uma doença infecciosa, não contagiosa, com média de 1,3 milhões de casos anuais. O Brasil apresenta a maior prevalência em notificações nas Américas e o agente específico é a espécie L. [V.] braziliensis. O diagnóstico é comumente realizado por uma associação de fatores clínicos, epidemiológicos e testes laboratoriais. As técnicas de abordagens imunológicas mais utilizadas na rotina laboratorial são a reação de imunofluorescência indireta (IFI) e o ensaio imunoenzimático (ELISA), porém, podem apresentar limitações. Com isso, abordagens imunológicas alternativas vêm sendo estudadas, e uma delas é a citometria de fluxo (CF). Sendo assim, o presente trabalho teve como objetivo avaliar através da citometria de fluxo, a participação da resposta imune humoral no desenvolvimento de lesões cutâneas em indivíduos com a doença ativa antes do tratamento (AT), e naqueles curados após o tratamento (PT). As amostras de soro utilizadas para os testes foram inativadas. Para os ensaios de CF formas promastigotas de L. (V.) braziliensis obtidas a partir da cepa de referência, foram expandidas em meio Schneider´s até atingirem a fase exponencial. Após etapas de lavagem, a concentração de parasitos foi ajustada e fixada no paraformaldeído a 1%. Para os ensaios de IFI e ELISA foram utilizados os antígenos totais da L. (V.) braziliensis. Para a CF e a IFI o anticorpo foi conjugado a um fluorocromo e no ELISA a uma enzima. Como resultados dos ensaios de IFI, dos soros avaliados, 92,85% (13/14) foram positivos AT, 61,54% (8/13) um ano, 70% (7/10) dois anos e 50% (5/10) cinco anos PT foram positivos. No teste de ELISA, 92,8% (13/14) dos pacientes AT foram positivos; e 53,8% (7/13) um ano PT, 88,8% (8/9) dois anos PT e 100% (5/5) cinco anos PT (5/5) continuaram com título positivo para LTA. Para a CF, foram identificados como positivos 86% (12/14) dos pacientes AT e 77% (10/13), 80% (8/10) e 70% (7/10) dos indivíduos, respectivamente, um, dois e cinco anos PT foram negativos para o ensaio de CF. Com a análise das curvas ROC comparando a performance dos três testes, observou-se que área sob a curva (ASC) da IFI (ASC=0,879; IC95%= 0,754-0,954) foi menor do que o teste de citometria de fluxo (ASC= 0,890; IC95%=0,767-0,961), compreendendo um desempenho menor em relação à citometria. Para comparação entre o ELISA e a CF se observou que área sob a curva (ASC) do ELISA (ASC=0,808; IC95%= 0,652-0,915) diferiu da observada para o teste de CF (ASC= 0,896; IC95%= 0,758-0,970), onde novamente a CF apresentou um desempenho superior. Com os resultados obtidos da padronização dos isotipos IgG1, IgG2 e IgG3, pôde se observar que a melhor diluição do isotipo IgG1 foi a diluição 1:400, para o isotipo IgG2, 1:100 e para o isotipo IgG3, 1:200. Na análise da aplicabilidade do isotipo IgG1, foi constatado que AT, 63,2% dos pacientes foram positivos e para os pacientes 1PT, 17,7%; 2PT, 72,8% e 5PT, 12,55% se apresentaram positivos. Dessa forma acredita-se que citometria de fluxo aplica-se ao diagnóstico da LTA por apresentar resultados positivos na presença da doença, sendo superior aos dois testes utilizados na rotina laboratorial para LTA e que a utilização do isotipo IgG1 tem amplas possibilidades para contribuir como um método de diagnóstico mais sensível e específico do que os métodos tradicionais.