Caracterização da enzima glutationa s-transferase alfa 1.2 recombinante de ostra Crassostrea gigas (Thunberg, 1793)

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Deconto, Vanessa Schadeck
Data de Publicação: 2022
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFSC
Texto Completo: https://repositorio.ufsc.br/handle/123456789/236850
Resumo: Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2022.
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spelling Caracterização da enzima glutationa s-transferase alfa 1.2 recombinante de ostra Crassostrea gigas (Thunberg, 1793)BioquímicaBiomarcadoresGlutationaOstra-do-pacíficoDissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2022.As Glutationa S-transferase (GSTs) são uma família de enzimas de biotransformação de fase II envolvidas na proteção contra vários xenobióticos. Suas diferentes isoformas são utilizadas como biomarcadores de contaminação aquática em diversos modelos animais, como no caso da ostra Crassostrea gigas, organismo utilizado neste estudo. A classe alfa das GSTs é conhecida por participar no metabolismo de diferentes compostos endógenos em vertebrados, além da sua reconhecida função na biotransformação de xenobióticos. Porém, pouco se sabe sobre as GSTs de C. gigas e as possíveis funções de cada classe. Em vista disso, este estudo visou realizar a caracterização estrutural e funcional de uma isoforma da classe alfa de GST (CgGSTA 1.2). Foram realizadas análises in silico por biologia computacional (modelagem tridimensional e docking molecular) a fim de contribuir com um direcionamento para os experimentos in vitro de cinética enzimática. A modelagem tridimensional da proteína foi realizada pelos programas I-TASSER e HADDOCK. A análise de docking molecular foi realizada pelo SwissDock utilizando as moléculas de glutationa reduzida (GSH), 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) e hidroperóxido de cumeno (CHP) como ligantes. As posições do ligante na cavidade da proteína foram avaliadas pela afinidade de ligação (?G), posição do ligante comparada a uma estrutura cristalográfica utilizada como controle e interações entre ligante e resíduos. Nas análises in vitro, a bactéria Escherichia coli cepa BL21 foi transformada com vetor de expressão com o gene de CgGSTA1.2. A proteína recombinante expressada foi purificada por cromatografia de afinidade por níquel, dialisada e teve a sua atividade in vitro avaliada testando substratos clássicos como CDNB e CHP. Testes com CDNB mostraram atividade de GST da enzima, e através das curvas de saturação foram estimados k? e V??? com valores crescentes de GSH na presença de valor fixo de CDNB. A isoforma ainda mostrou atividade de glutationa peroxidase com o substrato hidroperóxido de cumeno. Os resultados contribuem para a caracterização da família alfa de GSTs e permitirão a realização de estudos ecotoxicológicos mais específicos em moluscos bivalves.Abstract: Glutathione S-transferases (GSTs) are a family of phase II biotransformation enzymes involved in the protection against various xenobiotics. Its different isoforms are used as biomarkers of aquatic contamination in several animal models, as in the case of the oyster Crassostrea gigas, the species used in this study. The alpha class of GSTs is known to participate in the metabolism of different endogenous compounds in vertebrates, in addition to its well-known role in the biotransformation of xenobiotics. However, little is known about the GSTs of C. gigas and the possible functions for each class. So, this study aimed to characterize structural and functionally one isoform of the alpha class of GST (CgGSTA 1.2). In silico analysis were performed by computational biology (three-dimensional modeling and molecular docking) in order to contribute with a direction to the in vitro experiments of enzymatic kinetics. The protein three-dimensional modeling was performed using the I-TASSER and HADDOCK platforms. Molecular docking analysis was performed by the SwissDock platform using reduced glutathione (GSH), 1-Chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) and cumene hydroperoxide (CHP) as ligands. The obtained positions in the protein cavity were evaluated by the binding affinity (?G), ligand position compared to a control crystal structure used as a control and weak interactions between ligand and residues. For the in vitro analysis, bacterium Escherichia coli, strain BL21 was transformed with the expression vector containing the CgGSTA1.2 gene. The expressed recombinant protein was purified by nickel affinity chromatography, dialyzed and had its in vitro activity evaluated by testing classical substrates like CDNB and CHP. Tests with CDNB showed enzyme GST activity, and through saturation curves k? and V??? were estimated for increasing values of GSH in the presence of a fixed value of CDNB. The isoform showed glutathione peroxidase activity with the substrate cumene hydroperoxide. The results contribute to the characterization of the alpha family of GSTs and will allow accomplish more specific ecotoxicological studies in bivalve molluscs.Bainy, Afonso Celso DiasZacchi, Flávia LucenaUniversidade Federal de Santa CatarinaDeconto, Vanessa Schadeck2022-07-19T23:19:01Z2022-07-19T23:19:01Z2022info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesis100 p.| il., gráfs.application/pdf377430https://repositorio.ufsc.br/handle/123456789/236850porreponame:Repositório Institucional da UFSCinstname:Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)instacron:UFSCinfo:eu-repo/semantics/openAccess2022-07-19T23:19:01Zoai:repositorio.ufsc.br:123456789/236850Repositório InstitucionalPUBhttp://150.162.242.35/oai/requestopendoar:23732022-07-19T23:19:01Repositório Institucional da UFSC - Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)false
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