Desenvolvimento de método para detecção e quantificação evento-específico do feijoeiro Embrapa 5.1 por PCR em tempo real (qPCR)

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Treml, Diana
Data de Publicação: 2015
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFSC
Texto Completo: https://repositorio.ufsc.br/xmlui/handle/123456789/134658
Resumo: Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos, Florianópolis, 2015.
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spelling Desenvolvimento de método para detecção e quantificação evento-específico do feijoeiro Embrapa 5.1 por PCR em tempo real (qPCR)Ciência dos alimentosFeijãoDissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos, Florianópolis, 2015.Entre os métodos de quantificação de OGM para rotulagem de alimentos, o método que utiliza reação em cadeia de polimerase quantitativa (qPCR) evento-específico é o mais adequado. O evento feijoeiro GM Embrapa 5.1 foi aprovado para comercialização no Brasil em 2011, tornando necessário a sua rotulagem em alimentos. Nesse trabalho foi desenvolvido um método qPCR evento-específica para detecção de feijão GM Embrapa 5.1, pelo desenho de um par de iniciadores e uma sonda para a região de junção do DNA do feijão com o DNA recombinante. O método foi validado utilizando-se dois protocolos para a extração do DNA da folha do feijão: CTAB e DNeasy Plant Mini kit. A especificidade dos iniciadores na qPCR foi avaliada utilizando a metodologia SYBR Green. Os iniciadores apresentaram maior especificidade quando a quantidade final de iniciadores na reação de qPCR foi de 300 nM, com elevada especificidade. A sonda TaqMan foi desenvolvida para aumentar a especificidade, com melhores resultados obtidos utilizando-se uma quantidade final de sonda de 250 nM. Os ensaios de repetibilidade, através da amplificação das amostras compondo uma diluição seriada, apresentaram eficiências entre 85 e 103% para amostras de feijão GM Embrapa 5.1 das variedades Pérola e Pontal extraídas com DNeasy Plant mini kit e de 89 e 85% para as mesmas amostras extraídas pelo método CTAB. O limite de detecção do ensaio foi de 10² cópias de DNA quando o DNA de feijão GM foi diluído em DNA de feijão não GM, utilizando a metodologia TaqMan. A eficiência média da qPCR com amostras de semente de feijão Pérola GM Embrapa 5.1 extraídas com DNeasy Plant Mini kit, foi de 100%. O método de qPCR desenvolvido nesse trabalho apresenta parâmetros adequados quanto a especificidade, eficiência, linearidade e limite de detecção para a identificação e quantificação do evento feijão GM Embrapa 5.1.<br>Abstract : Among the methods for GMO quantification for food labeling, the method that uses quantitative event-specific polymerase chain reaction (qPCR) is the most suitable. The event GM common bean Embrapa 5.1 was approved for commercialization in Brazil, in 2011. So, it is necessary to label it in foods. In this work it was developed an event-specific qPCR method to detect GM common bean Embrapa 5.1, through the design of a primer pair and a probe that target the region of junction of common bean DNA with the recombinant DNA. The method was validated using two protocols to DNA extraction from common bean leaves: CTAB and DNeasy plant mini kit. The specificity of the primer pair was assessed using SYBR Green. The primers showed higher specificity when the final quantity of primer was 300 nM. One TaqMan probe was developed to increase the specificity with best results achieved when the probe concentration was 250 nM. The repeatability assay, through the amplification of samples serially diluted in water, showed efficiencies between 85 and 103% for varieties of Pérola and Pontal GM common bean Embrapa 5.1 extracted with DNeasy Plant mini kit and of 89 and 85% for the same samples extracted with CTAB. The limit of detection of the assay was 10² copies when DNA of GM common bean was diluted in DNA of non-GM common bean using a TaqMan probe. The mean efficiency of qPCR with samples of grain of GM Pérola 5.1 extracted with DNeasy Plant mini kit was of 100%. The qPCR method developed in this work showed suitable parameters regarding to specificity, efficiency, linearity and limit of detection for the identification and quantification of the event Embrapa 5.1.Arisi, Ana Carolina MaisonnaveUniversidade Federal de Santa CatarinaTreml, Diana2015-09-01T04:07:45Z2015-09-01T04:07:45Z2015info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesis95 p.| il., grafs, tabs.application/pdf334055https://repositorio.ufsc.br/xmlui/handle/123456789/134658porreponame:Repositório Institucional da UFSCinstname:Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)instacron:UFSCinfo:eu-repo/semantics/openAccess2016-03-07T18:54:58Zoai:repositorio.ufsc.br:123456789/134658Repositório InstitucionalPUBhttp://150.162.242.35/oai/requestopendoar:23732016-03-07T18:54:58Repositório Institucional da UFSC - Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)false
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