Caracterização genética e bioquímica da BKC-1, uma nova carbapenemase da classe A de Ambler, isolada de amostras clínicas de Klebsiella pneumoniae

• Autor(a) principal: Nicoletti, Adriana Giannini [UNIFESP]
• Data de Publicação: 2014
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNIFESP
• Texto Completo: http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/23264
• topic: Carbapenêmicos; Klebsiella pneumoniae; Enterobacteriaceae; beta-Lactamases; Hidrólise

Em bacilos Gram negativos, a produção de β-lactamases é o fator contribuinte mais importante para a aquisição de resistência aos antimicrobianos β-lactâmicos. As carbapenemases, β-lactamases com eficiência catalítica contra os carbapenens, representam a família mais versátil destas enzimas, possuindo um amplo espectro de atividade, que compreende quase todos os antimicrobianos β-lactâmicos. O objetivo deste estudo foi caracterizar geneticamente e bioquimicamente uma nova carbapenemase da classe A de Ambler, identificada em amostras clínicas de Klebsiella pneumoniae resistentes aos carbapenens, isoladas de dois hospitais da cidade de São Paulo. Material e métodos: O teste de sensibilidade foi realizado pela técnica de microdiluição, de acordo com as recomendações do CLSI. O teste de hidrólise foi realizado para verificar se as amostras eram capazes de degradar o imipenem por meio da produção de enzimas. A reação da cadeia em polimerase foi utilizada para a detecção dos genes codificadores de β-lactamases, seguida pela reação de sequenciamento dos respectivos amplicons. A corrida eletroforética em géis de poliacrilamida com intervalos conhecidos de pH foi realizada para determinar o pI das β-lactamases presentes. A relação genética entre as amostras foi determinada pela técnica de PFGE, e o perfil plasmidial foi determinado por meio de eletroforese em gel de agarose 0,8% após a extração dos plasmídeos por duas metodologias diferentes. A transformação foi utilizada para determinar se o gene responsável pela resistência aos carbapenens estava localizado no plasmídeo, seguido pelo sequenciamento em larga escala do plasmídeo carreador do gene de resistência aos carbapenens. Após a identificação do gene, experimentos de cinética enzimática foram realizados para determinar os parâmetros bioquímicos da nova enzima. A determinação da frequência do gene blaBKC foi realizada por PCR para uma coleção de 472 amostras de Klebsiella spp. Resultados: O teste de sensibilidade confirmou a resistência a todos os antimicrobianos testados, incluindo os carbapenens, as quinolonas, e os aminoglicosídeos canamicina e amicacina. A hidrólise dos carbapenens foi detectada em todos os isolados, sendo inibida somente pelo ácido clavulânico. A PCR revelou a presença dos genes blaCTX-M-2 e blaSHV-like. Entretanto, nenhum gene codificador de carbapenemases foi detectado. As três amostras pertenciam ao mesmo clone e apresentaram o mesmo perfil plasmidial, com a presença de quatro plasmídeos (2, 8, 10 e 140 Kb). Somente o plasmídeo de 10 Kb foi recuperado da cepa transformante, sendo totalmente sequenciado. Além dos genes de mobilização e replicação, o plasmídeo também apresentou o gene aphA, responsável pela resistência aos aminoglicosídeos, e uma ORF que codificava uma proteína de 313 aminoácidos correspondente a uma β-lactamase, que foi nomeada de blaBKC. Esta enzima possui maior similaridade com uma β-lactamase presente no plasmídeo do Sinorhizobium meliloti AK83 (63%). O transformante mostrou um aumento de 10 vezes na CIM do ertapenem. Dentre as 472 amostras pesquisadas, somente uma carreava o gene blaBKC, correspondendo a uma frequência de 0,2%, Conclusões: Apesar da disseminação de K. pneumoniae produtora de KPC no Brasil, nós identificamos uma nova carbapenemase pertencente a classe A, demonstrando a diversidade e rápida evolução das β-lactamases em isolados clínicos de K. pneumoniae..