Análise mutacional do gene COL7A1 nos pacientes brasileiros e terapia gênica para epidermólise bolhosa distrófica recessiva com macrófagos modificados com COL7A1 em modelo murino

• Autor(a) principal: Martin, Priscila Keiko Matsumoto [UNIFESP]
• Data de Publicação: 2016
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNIFESP
• Texto Completo: https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=3487251; http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/47686
• topic: Epidermólise bolhosa distrófica recessiva; Macrófagos; Colágeno vii; Sequenciamento gênico; Terapia gênica; Recessive dystrophic epidermolysis bullosa; Macrophages; Collagen vii; Gene sequencing; Gene therapy

A Epidennólise Bolhosa Distrófica Recessiva (EBDR) é uma doença monogênica muito agressiva cuja ausência de colágeno VII causa bolhas e lesões em todos os epitélios. Não há tratamento eficaz até o momento e o diagnóstico da doença ainda é apenas clínico no Brasil. Devido à grande variabilidade de conjuntos de mutações e os diversos tipos de epidennólises já descritos, o sequenciamento do gene COL 7AI seria essencial para. completar o diagnóstico da doença. No entanto, o sequenciamento não está incluso nos critérios de diagnóstico e nem disponível a todos os pacientes com EBDR, uma vez que a variabilidade das mutações dificulta a análise deste gene muito grande por técnicas simples e baratas. Através do sequenciamento do gene COL 7AI pela técnica de NGS (next generation sequencing) foram identificadas as mutações eri126 pacientes, sendo que 22 pacientes tiveram o diagnóstico de EBDR. Houve a identificação de 6 novas mutações ainda não descritas na literatura (c.8047-1 G>A, c.1758_I758delC, c.2783_2784insGACAC, c.2903C>T, c.3649G>A e c.8I9IG>T), sendo que duas delas foram vistas em mais de um alelo do gene (c.1758_1758deIC, c.2783_2784insGACAC). A mutação mais frequente nos pacientes,e com maior frequência alélica (25%) foi a mutação c.5047 C>T. Dez pacientes apresentaram mutações homozigóticas e nove são resultantes de casamentos consanguíneos. As mutações em sítio de splice c. 8304+ I G>A e c.8047-I G>A foram identificadas pelo sequenciamento dos íntrons, e podem ser alvo de terapias como éxon skiping ou edição genômica, em vez da inserção do gene COL7AI inteiro, um processo mais trabalhoso. Como os pacientes com EBDR sofrem exclusivamente da deficiência do colágeno VII, macrófagos foram modificados para expressar o gene COL 7AI sob o controle de promotores específicos sintético - o promotor Scavenger. Pensando em um protocolo clinico no futuro, o sistema não-viral Sleeping Beauty foi usado para integração do gene. Inicialmente a nucleofecção foi testada em células-tronco hematopoiéticas de camundongos (CTH) e macrófagos primários (PMM). In vitro vimos uma alta expressão de colágeno VII após a transfecção do vetor pT2-SP-Col7 nas células HEK293T e nos PMM, mas as CTH não permaneceram viáveis após a nucleofecção. Para os experimentos in vivo nos animais nocaute para o gene COL7AI (camundongo Col7AI -/-), os PMM foram nucleofectados com pT2-SP-Col7e pCMV-SBIOOX (expressa o Sleeping Beauty) e marcados com CM-Dil. Foi realizada a injeção intradérmica e intraperitoneal em am ongos neonatos Col AI -1-. Houve um aumento na sobrevida dos animais tratados que variou de 7 a 21 dias dependendo do tipo de tratamento. Nenhum dos animais apresentou lesões ou bolhas durante o período de avaliação, e possuíam tamanho e peso correspondente à metade do camundongo WT. Os PMM injetados foram localizadas na pele e o colágeno VII humano foi visto intracelularmente e na matriz extracelular. No camundongo que recebeu as células via intraperitoneal, a expressão e colágeno VII e os macrófagos foram vistos no baço, intestino e pele, indicando que houve migração dos PMM para a pele. Logo, a terapia com macrófagos expressando colágeno VII mostrou-se bastante promissora no aumento da sobrevi da dos animais Col7 AI -/- tratàdos.