Produção em escala laboratorial e caracterização de variantes do colágeno tipo VII humano recombinante resistentes à clivagem por metaloproteinases de matriz

• Autor(a) principal: Alcorte, Mariel Dourado
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-05012021-135737/
• topic: Colágeno; Colágeno VII recombinante; Collagen VII; Epidermólise bolhosa distrófica recessiva; Proteínas recombinantes; Recessive dystrophic epidermolysis bullosa; Recombinant collagen; Recombinant protein; Variantes do rCOL7A1; Variants forms of rCOL7A1

A Epidermólise Bolhosa Distrófica Recessiva (EBDR) é um distúrbio mecanobolhoso da pele causado por mutações no gene COL7A1, que codifica a proteína de colágeno VII (COL7A1). O fenótipo desta doença rara é caracterizado pelo aparecimento de bolhas, pela fragilidade da pele associada a pequenos traumas ou trações nos tecidos afetados, e por um processo de cicatrização de feridas incessante e mutilante. Atualmente, a EBDR não tem cura, sendo o tratamento apenas paliativo, principalmente das bolhas e infecções cutâneas. O COL7A1 é uma glicoproteína de 2.944 aminoácidos encontrada principalmente na membrana basal, sendo o componente majoritário das fibrilas de ancoragem, que são estruturas responsáveis pela promoção da aderência da derme à epiderme. Algumas opções de tratamentos para a EBDR estão sendo exploradas, dentre elas a terapia de reposição empregando o COL7A1 humano recombinante (rCOL7A1). Estudos utilizando camundongos nocaute para o gene Col7a1 demostraram que a aplicação tópica, injeções intradérmicas, e administração intravenosa de rCOL7A1 proporcionaram a reconstituição das fibrilas de ancoragem, e uma reversão parcial do fenótipo da EBDR. Trabalhos científicos indicam que o tempo de meia-vida do COL7A1 é de aproximadamente um mês, sugerindo uma frequência mensal de administração do rCOL7A1. A degradação do COL7A1 ocorre pela atuação das metaloproteinases de matriz 1 (MMP-1) e 2 (MMP-2), que, quando inibidas, favorecem a formação de fibrilas de ancoragem, sugerindo que a introdução de uma alteração dos sítios de clivagem do COL7A1 pelas MMP-1 ou MMP-2 proporcionaria um aumento do tempo de meia-vida das fibrilas de ancoragem. O presente trabalho de mestrado busca contribuir para a obtenção de uma opção terapêutica inédita para a EBDR, tendo como objetivo a obtenção de formas variantes de rCOL7A1 possivelmente resistentes à ação proteolítica das MMP-1 e MMP-2. Os objetivos específicos envolveram a produção em escala laboratorial, bem como a avaliação bioquímica e estrutural, de três formas variantes de rCOL7A1, putativamente resistentes à MMP-2 (COL7A1V1), à MMP-1 (COL7A1V2), e às MMP-1 e MMP-2 (COL7A1V3). Células CHO-DG44 foram transfectadas estavelmente com os vetores de expressão das formas selvagem e variantes do rCOL7A1, e submetidas ao processo de indução da amplificação gênica. Foram obtidas as linhagens celulares produzindo estavelmente o rCOL7A1 selvagem e os variantes COL7A1V1, COL7A1V2 e COL7A1V3. As proteínas produzidas foram caracterizadas por Western blot demonstrando a integridade estrutural da forma monomérica e a capacidade de formação da forma trimérica in vitro. Os resultados obtidos constituem os primeiros passos para a caracterização bioquímica mais detalhada das formas variantes de rCOL7A1 potencialmente resistentes à degradação mediada pelas MMP1 e MMP2.