Produção de proteases de Monacrosporium thaumasium (NF34a) e sua utilização no controle de larvas de Angiostrongylus vasorum

• Autor(a) principal: Soares, Filippe Elias de Freitas
• Data de Publicação: 2012
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: LOCUS Repositório Institucional da UFV
• Texto Completo: http://locus.ufv.br/handle/123456789/2451
• topic: Proteases; Monacrosporium thaumasium; Angiostrongylus vasorum; Protease; Monacrosporium thaumasium; Angiostrongylus vasorum; CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA::METABOLISMO E BIOENERGETICA

Angiostrongylus vasorum é um nematóide que parasita cães domésticos e canídeos silvestres. O tratamento do hospedeiro definitivo (cães) é realizado com a utilização de antihelmínticos, contudo, devido à sua importância em humanos e animais, justifica-se o estudo de medidas alternativas que possam contribuir para o controle desse nematóide. Nesse contexto, a aplicação do controle biológico realizado com fungos nematófagos é uma alternativa que apresenta grande potencial. Fungos nematófagos produzem proteases extracelulares as quais podem estar diretamente envolvidas em diversas etapas da infecção dos ovos e das larvas. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo otimizar a produção, purificar, caracterizar e avaliar a aplicação da protease do fungo nematófago Monacrosporium thaumasium (NF34a) no controle de larvas de primeiro estádio de A. vasorum. Micélios fúngicos foram obtidos através da transferência de discos de cultura do isolado mantido em corn-meal-ágar 2% (CMA 2%) e transferidos para frascos contendo 50 ml de meio líquido que teve sua composição otimizada para a produção de protease. Em seguida, a protease foi purificada e caracterizada em relação ao seu pH, temperatura, termoestabilidade e influencia de sais no meio de reação. Por fim, foi demonstrada a atividade larvicida do extrato bruto e da protease purificada de M. thaumasium (NF34) sobre larvas de primeiro estágio de A. vasorum. O extrato de levedura, nos níveis avaliados, apresentou um efeito significativo (p<0,05) sobre a produção de protease. Observou-se também que a variável pH teve significância (p<0.1) sobre a produção de protease. Uma protease (Mt1) produzido por NF34a foi purificada em apenas um passo, utilizando-se uma cromatografia de troca iônica em pH 8,0. A massa molecular da enzima purificada (Mt1) foi de aproximadamente de 40 kDa. A atividade máxima da protease foi obtido na faixa de pH entre 7,0 e 8,0 e a 60 ºC. Os íons Mg+2 e o Zn+2 inibiram parcialmente a atividade de Mt1, enquanto o PMSF inibiu-a por completo. Por outro lado, Ca+2 causou um ligeiro aumento da atividade da protease. Em relação à atividade enzimática sobre L1 de A. vasorum, no intervalo de 24 horas, o extrato bruto produzido por NF34a, reduziu em 77,4% o número de larvas (p<0.05), enquanto a Mt1 reduziu em 23.9% o número das L1 de A. vasorum (p<0.05), em relação ao controle. Tanto o extrato bruto quanto a Mt1, mantiveram suas atividades biológicas intactas após incubação em temperatura de 28º C, durante 7 dias. Foi observada a produção de Mt1 quando M. thaumasium (NF34a) cresceu utilizando-se L1 de A. vasorum como única fonte de carbono e nitrogênio. Esses resultados demonstraram que a enzima pode ter um relevante papel no processo de infecção das larvas. Assim, maiores estudos sobre o mecanismo molecular da interação do fungo M. thaumasium com nematóides potencialmente zoonóticos são necessários.