Caracterização de mutantes de Trypanosoma cruzi deficientes em dipeptidil peptidase 8 e produção de anticorpos contra proteínas ligadoras de RNA (UBP1Tc e UBP2Tc)

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Castro, Natália Alves de
Data de Publicação: 2019
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UnB
Texto Completo: http://repositorio.unb.br/handle/10482/35370
Resumo: Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2019.
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spelling Caracterização de mutantes de Trypanosoma cruzi deficientes em dipeptidil peptidase 8 e produção de anticorpos contra proteínas ligadoras de RNA (UBP1Tc e UBP2Tc)Chagas, Doença deDoença de ChagasTrypanosoma cruziExpressão gênicaProteasesDissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2019.A doença de Chagas é uma patologia crônica, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, endêmica em países da América Latina. Entretanto, possui impacto mundial uma vez que estudos econômicos indicam um custo de 7,2 bilhões de dólares por ano associado a doença. O medicamento disponível para seu combate, benzonidazol, apresenta baixa eficácia em fase crônica e a grande complexidade biológica do organismo dificulta o desenvolvimento de novos fármacos. Portanto, se faz necessário o melhor entendimento do tripanossomatídeo, assim como das moléculas envolvidas nos seus processos celulares. Nesse aspecto se sobressaem a dipeptidil peptidase 8 (DPP8Tc), que ainda não possui sua função biológica conhecida, mas apresenta homólogos com papel importante em diversas patologias, e as proteínas ligadoras de RNA (UBP1Tc e UBP2Tc), por sua atuação na regulação da expressão gênica. O presente trabalho almejou contribuir com a elucidação da função da DPP8Tc e produzir ferramentas para estudos posteriores sobre as RPBs. Linhagens de T. cruzi simples nocaute para o gene dpp8tc foram caracterizadas, sendo observado uma diminuição na taxa de metaciclogênese do clone F9, que apresentou a menor expressão da proteína vista por western blot e imunofluorescência. Ensaios de metabolômica mostraram uma maior produção de prolina intracelular no clone C8, e o estudo da expressão de outras proteases permitiu se constatar uma superexpressão de enzimas da mesma família (POPTc80, OPBTc) nos mutantes simples. Além disso, as formas tripomastigotas metacíclicas selvagens apresentaram menor expressão da DPP8Tc em relação as formas epimastigotas. Em conjunto, esses dados indicam um possível papel dessa enzima no processo de diferenciação. A tentativa de duplo nocaute foi realizada por meio da técnica de CRISPR-Cas9, ainda que este não pôde ser confirmado. Ademais, as RBPs, UBP1Tc e UBP2Tc foram expressas de forma heteróloga, e anticorpos policlonais foram produzidos para essas proteínas. Esses anticorpos serão importantes ferramentas de validação para estudos proteômicos da interação entre RBPs e RNAs.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq); Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAP/DF); Fundação de Apoio para Pesquisa, Ensino, Extensão e Desenvolvimento Institucional (FINATEC) e COFECUB.Chagas disease is a chronic pathology, caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, and is endemic in Latin American countries. However, it has a worldwide impact, since economic studies indicate an annually cost of 7.2 billion of dollars associated with the disease. Its available treatment, benznidazole, has low efficacy in the chronic phase, and the great biological complexity of the organism hinders the development of new drugs. Therefore, it is necessary to have a better understanding of the trypanosomatid, as well as the molecules involved in their cellular processes. In this aspect are highlighted the dipeptidyl peptidase 8 (DPP8Tc), which does not have its biological function known, but presents homologues with important role in several pathologies, and the RNA-binding proteins (UBP1Tc e UBP2Tc) for their performance in the regulation of gene expression. The present work aimed to contribute to the elucidation of DPP8Tc function and to produce tools for further studies on RPBs. T. cruzi single knockouts for the dpp8tc gene were characterized, with a decrease in the metacyclogenesis rate of clone F9, which also showed the lowest expression of the protein seen by western blot and immunofluorescence. Metabolomic assays showed higher production of intracellular proline in clone C8, and the study of the expression of other proteases revealed an overexpression of enzymes of the same family (POPTc80, OPBTc) in the single mutants. In addition, wild type metacyclic trypomastigote forms showed lower expression of DPP8Tc in relation to epimastigote forms. Together, these results indicate a possible role of this enzyme in the differentiation process. The double knockout attempt was performed using the CRISPR-Cas9 technique, although this could not be confirmed. In addition, the RBPs, UBP1Tc and UBP2Tc were expressed in procariote system, and polyclonal antibodies were produced for these proteins. These antibodies will be important validation tools for proteomic studies of the interaction between RBPs and RNAs.Bastos, Izabela Marques DouradoCastro, Natália Alves de2019-08-27T20:47:45Z2019-08-27T20:47:45Z2019-08-272019-02-26info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfCASTRO, Natália Alves de. Caracterização de mutantes de Trypanosoma cruzi deficientes em dipeptidil peptidase 8 e produção de anticorpos contra proteínas ligadoras de RNA (UBP1Tc e UBP2Tc). 2019. xi, 87 f., il. Dissertação (Mestrado em Patologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2019.http://repositorio.unb.br/handle/10482/35370A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.info:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNB2023-07-13T18:07:37Zoai:repositorio.unb.br:10482/35370Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2023-07-13T18:07:37Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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