Inibição mediada pelo EDTA protege o DNA fetal livre de células de degradação ex-vivo em amostras de sangue

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Vasques, Júlia de Almeida
Data de Publicação: 2014
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UnB
Texto Completo: http://dx.doi.org/10.26512/2014.12.D.17994
Resumo: Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2014.
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spelling Inibição mediada pelo EDTA protege o DNA fetal livre de células de degradação ex-vivo em amostras de sangueDNAPlasma maternoDNaseDNA fetalDNA fetal livre de células (cffDNA)DNA livre de células (cfDNA)Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2014.O impacto pré-analítico da atividade DNase existente no sangue sob o DNA livre de célula (cfDNA) não está claro e nem foi bem estudado. Como o cfDNA fetal (cffDNA) se origina da placenta, o aporte termina quando o sangue materno é colhido e a sua quantidade não aumenta na amostra ex-vivo, ao contrário do que pode ocorrer com o cfDNA genômico. Portanto, o cffDNA é uma ferramenta sensível para avaliar a atividade e o impacto ex-vivo destas enzimas que degradam DNA, sendo este o objetivo do presente estudo. O plasma-EDTA e o soro de mulheres grávidas de fetos masculinos foram submetidas à diferentes condições de temperaturas, de modo a investigar a estabilidade do cffDNA. Em seguida, a ação de uma DNase exógena sobre o cffDNA foi avaliada tratando ou não as amostras com DNAse I. Em todas as situações, o cffDNA foi quantificado utilizando sequências-alvo específicas do cromossomo Y (DYS-14). Além disso, desenvolveu-se um ensaio baseado na degradação de uma sonda de hidrólise para qPCR com a finalidade de medir a atividade DNase endógena diretamente em amostras primárias. Por fim, uma diluição seriada de EDTA foi adicionada ao plasma fresco (não-anticoagulado) e ao soro antes do ensaio para medir a atividade DNase endógena com afinalidade de pesquisar a inibição das DNases sanguíneas mediada por este anticoagulante. Observou-se uma menor quantidade de cffDNA no soro em relação ao plasma. Além disso, uma maior diminuição do cfDNA mediada pela temperatura foi observada no soro quando comparada ao plasma-EDTA. O tratamento com a DNAse I não alterou o cffDNA no plasma, mas causou a sua degradação total no soro. Adicionalmente, a atividade DNase endógena foi de 14,9 vezes maior no soro quando comparada ao plasma-EDTA. Por fim, a adição de doses crescentes de EDTA ao plasma fresco e ao soro resultaram em uma inibição dose-depedente da atividade DNase endógena nestas amostras. Em conclusão, cffDNA está protegido de degradação mediada pela temperatura no plasma-EDTA. DNases endógenas e exógenas estão mais ativas no soro e o anticoagulante EDTA inibe as DNases do sangue conferindo proteção exvivo ao cffDNA.The preanalytical impact of the blood's nuclease activity over the cell-free DNA in clinical samples is neither clear nor well studied. Since cell-free fetal DNA (cfDNA) originates from placenta, the supply is lost after maternal blood draw and its quantity does not increase in the ex-vivo sample, as the genomic DNA. Thus, cfDNA is a sensitive tool to evaluate the activity and the impact of the DNA degrading enzymes present in the blood and it was the aim of the present study. We develop a DNase activity assay based on a qPCR hydrolysis probe degradation in order to investigate the endogenous DNA degrading activity of the crude specimens. EDTA-plasma and serum from women bearing a male fetus were submitted to this assay. Morever, the action of an exogenous DNase over cfDNA was investigated by samples treatment with DNase I. A serial dilution of EDTA was added to a fresh plasma (nonanticoagulated) and serum before the endogenous DNase activity assay to investigate the EDTA-mediated inhibition of blood's DNases. Furthermore, EDTAplasma and serum were exposed to different temperature conditions to investigate the cfDNA stability. In all instances, the male cfDNA quantities were measured by qPCR targeting the Y chromosome-specific sequences (DYS-14). The endogenous nuclease activity was 14.9-fold higher in serum compared to EDTA-plasma. The DNAse I treatment did not alter the cfDNA yields in EDTA-plasma, but degrades it extremely low levels in serum. Increasing doses of EDTA to fresh plasma and serum resulted in a stepwise inhibition of their DNase activities. Additionally, there was lower cfDNA yields in serum compared to the paired EDTA-plasma. Moreover, we observed a much more pronounced temperature-mediated decrease on the cfDNA amount in serum compared to EDTA-plasma. The cfDNA is protected from a temperature-triggered degradation in EDTA-plasma. Exogenous and endogenous nucleases were more active in serum and the anticoagulant EDTA inhibits blood nucleases conferring an ex-vivo protection to cfDNA.Faculdade de Ciências da Saúde (FS)Programa de Pós-Graduação em Ciências da SaúdeBarra, Gustavo BarcelosVasques, Júlia de Almeida2015-04-27T15:18:32Z2015-04-27T15:18:32Z2015-04-272014-12-16info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfVASQUES, Júlia de Almeida. Inibição mediada pelo EDTA protege o DNA fetal livre de células de degradação ex-vivo em amostras de sangue. 2014. 48 f., il. Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde)—Universidade de Brasília, Brasília, 2014.repositorio.unb.br/handle/10482/17994http://dx.doi.org/10.26512/2014.12.D.17994A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.info:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNB2024-02-06T20:48:11Zoai:repositorio.unb.br:10482/17994Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2024-02-06T20:48:11Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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