Estabelecimento do processo de purificação da proteína rhPDGF-BB produzida em células HEK 293T

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Gioia, Caterina Luz
Data de Publicação: 2019
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UnB
Texto Completo: https://repositorio.unb.br/handle/10482/37076
Resumo: Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, Programa de Pós-Graduação em Tecnologias Química e Biológica, 2019.
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spelling Estabelecimento do processo de purificação da proteína rhPDGF-BB produzida em células HEK 293TBiofármacosPurificação de proteínasProteínas recombinantesDissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, Programa de Pós-Graduação em Tecnologias Química e Biológica, 2019.As úlceras nas extremidades dos membros de pacientes diabéticos são complicações comuns que atingem cerca de 15% dos pacientes e que podem levar à graves consequências como a amputação de membros. O Becaplermin (Regranex®), produzido em Saccharomyces cerevisiae, é um fármaco comercializado e utilizado para o tratamento de tais feridas, através da atuação do homodímero da subunidade B do Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas (PDGF-BB). A proteína recombinante humana (rh) PDGF-BB atua nos processos de cicatrização por sua ação quimiotática, ativando mecanismos celulares, como angiogênese e mitogênese; pode ser utilizada também na regeneração óssea e periodontal. Entretanto, efeitos adversos como erupção bolhosa, queimação no local de aplicação e hipertrofia da pele são relatados com o uso do Becaplermin. Tais relatos podem ser atribuídos ao sistema de expressão, que promove modificações pós-traducionais não expressadas em humanos, levando a uma resposta imune no organismo. A produção de proteínas recombinantes por células de mamífero (HEK 293T, por exemplo) gera moléculas que apresentam menor risco de efeitos colaterais quando comparadas a outros sistemas de expressão, pois possuem as modificações pós-traducionais que se assemelham às produzidas em humanos, bem como secretam a maioria das proteínas no meio de cultura, facilitando sua recuperação sem necessidade do rompimento celular. Esse trabalho teve como objetivo o estudo do estabelecimento do processo de purificação da proteína rhPDGF-BB produzida em células HEK 293T para duas colunas (HiTrap Heparin HP e HiTrap Phenyl FF), assim como a validação de testes colorimétricos para monitoramento de glicose, lactato, glutamina e ureia durante o cultivo celular e estudo do metabolismo. Os testes colorimétricos elaborados apresentaram valores subestimados para lactato e superestimados para glicose quando comparado aos resultados obtidos por HPLC, porém as curvas nos gráficos possuem perfil similar, indicando que podem ser utilizados como guias para entender a metabolização celular no meio de cultivo durante o processo de produção, possibilitando a tomada de decisões de forma rápida. A purificação do rhPDGF-BB na coluna HiTrap Heparin HP já é conhecida e gerou picos únicos e centralizados na eluição, mas a constatação da presença da proteína de interesse no pico purificado não foi possível devido à problemas com equipamentos. A coluna HiTrap Phenyl FF (High Sub) possui menor custo de compra e por isso se apresentou como uma boa alternativa à coluna de heparina, realizando testes de purificação da proteína para ela. O estabelecimento da purificação com esta coluna não foi estabelecido, pois o pico obtido estava deslocado para o final da eluição e não se encontrou molaridade adequada do sal utilizado para centralizar o pico de purificação. Entretanto, apresentou pico com altura similar à altura alcançada na coluna de heparina, apresentando-se como uma alternativa promissora para a continuação de estudos para outros sais e molaridades.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).Ulcers at the extremities of the limbs of diabetic patients are common complications which affects about 15% of patients and can lead to serious consequences such as limb amputation. Becaplermin (Regranex®), produced in Saccharomyces cerevisiae, is a drug marketed and used for the treatment of such wounds, through the action of the B subunit homodimer of Platelet Derived Growth Factor (PDGF-BB). The human recombinant (rh) PDGF-BB acts in the cicatrization through its chemotactic action, promoting cellular mechanisms such as angiogenesis and mitogenesis, and can be used for other treatments such as bone and periodontal regeneration. However, side effects such as bullous eruption, burning at the site of application and hypertrophy of the skin are reported with the use of Becaplermin and can be attributed to the expression system, which promotes post translational modifications not expressed in humans, which may lead to an immune response in the human body. The production of recombinant proteins by mammalian cells (HEK 293T, for example) generates molecules that present less risk of side effects when compared to other expression systems, since they have the post translational modifications that resemble those produced in humans, as well as secrete most of the proteins in the medium, facilitating their recovery without the need for cellular disruption. The aim of this study was to establish the purification process of the rhPDGF-BB protein produced in HEK 293T cells for two different columns (HiTrap Heparin HP and HiTrap Phenyl FF), as well as the validation of colorimetric tests for glucose, lactate, glutamine and urea during cell culture and metabolism study. The colorimetric tests presented values that were underestimated and overestimated for the analyzes when compared to the results obtained by HPLC. However, they had a similar curve profile in the graph and could be used as a guide to understand the cellular situation in the culture medium in a rapidly manner. Purification of rhPDGF-BB on the HiTrap Heparin HP column is already known and generated single and centered elution peaks, but the proofing of the presence of the protein of interest in the purified peak was not possible due to equipment problems. The HiTrap Phenyl FF (High Sub) column has a lower cost of purchase and therefore presented itself as a good alternative to the heparin column, being performs purifications tests of the protein for it. The process optimization was not established because the obtained peak was displaced towards the end of the elution and no adequate molarity of the salt used to centralize the purification peak was found. However, it presented a peak with similar height to the height reached in the heparin column, being presented as a promising alternative worthy of the continuation of studies for other salts and molaritiesCarmo, Talita SouzaGioia, Caterina Luz2020-03-11T19:27:18Z2020-03-11T19:27:18Z2020-03-112019-06-26info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfGIOIA, Caterina Luz. Estabelecimento do processo de purificação da proteína rhPDGF-BB produzida em células HEK 293T. 2019. 103 f., il. Dissertação (Mestrado em Tecnologias Química e Biológica)—Universidade de Brasília, Brasília, 2019.https://repositorio.unb.br/handle/10482/37076A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.info:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNB2023-07-17T20:20:26Zoai:repositorio.unb.br:10482/37076Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2023-07-17T20:20:26Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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