Estudo do efeito da metformina nas vias de sinalização relacionadas à sobrevivência e proliferação celular em linhagens de Feocromocitoma

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Meireles, Cinthia Gabriel
Data de Publicação: 2018
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UnB
Texto Completo: https://repositorio.unb.br/handle/10482/41660
Resumo: Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2018.
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spelling Estudo do efeito da metformina nas vias de sinalização relacionadas à sobrevivência e proliferação celular em linhagens de FeocromocitomaFeocromocitomaMetforminaSunitinibeVHLSDHBTese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2018.Os feocromocitomas são tumores neuroendócrinos raros, derivados de células cromafins que se localizam na medula das glândulas adrenais, sendo responsáveis pelo armazenamento, síntese e secreção de catecolaminas. Pacientes acometidos por este tipo de tumor apresentam alto risco de doenças cardiovasculares e as opções terapêuticas são pouco efetivas. Pensando nisso, o objetivo desse estudo foi investigar o efeito da metformina nas vias de sinalização relacionadas à sobrevivência e proliferação celular em linhagens celulares de feocromocitoma. Os métodos selecionados para este estudo foram: viabilidade das células de feocromocitoma, por MTT, exclusão por azul de tripan; ensaio de proliferação das células de feocromocitoma com incorporação de BrDu; coloração com cristal de violeta. Ensaio de western blot para avaliar: caspase 3, via de proliferação celular AMPK/ PTEN/AKT/mTOR/p70S6K/HIF1α e inibição do proteassoma em células de feocromocitoma de ratos; Ensaio de expressão dos genes: isoformas da HIF, VEGFA e VEGFR, ADM e ANGP em cultura primária de feocromocitoma; Imunofluorescência para KI-67, DAPI e DRP-1; Ensaio de peroxidação lipídica; ensaio de respiração celular. Os resultados mostraram que o sunitinibe (fármaco padrão) e a metformina reduzem a viabilidade das células de fibroblasto em 60% pelo método de MTT, mas não altera pelo ensaio de azul de tripan, em contrapartida, nas células de feocromocitoma, a viabilidade é reduzida em aproximadamente 50% e 60%, respectivamente. A redução da proliferação chega a 40% tanto com sunitinibe quanto com metformina nas células de feocromocitoma. A metformina parece alterar a viabilidade das células tumorais com efeito agudo. A clivagem da caspase 3 e a modificação da via AMPK/PTEN/AKT/mTOR/p70S6K/HIF1α, ocorreu apenas quando as células foram tratadas com metformina. Tanto a metformina quanto o sunitinibe promovem alterações nucleares que sugerem apoptose. A metformina só altera a expressão do gene VEGFR e induz a degradação da HIF pelo proteassoma das células de feocromocitoma. Metformina modifica a dinâmica mitocondrial de células silenciadas para o gene VHL via Drp-1. Os resultados sugerem que a metformina induz a peroxidação lipídica, inibe e altera todos os parâmetros da respiração celular e, em concetrações baixas reduz a respiração de células silenciadas para os genes VHL e SDHB. Como conclusão, os resultados deste estudo sugerem que a metformina: a. regular a viabilidade de células de feocromocitoma e de fibroblastos de pele humana, mas esse efeito seletivo ocorre em condições agudas; b. induz a apoptose celular via caspase 3 e inibe a proliferação celular via AMPK/PTEN/AKT/mTOR/p70S6K/HIF1α; a metformina não modifica a via AMPK/PTEN/AKT nas células da cultura primária, mas modifica mTOR/p70S6K/HIF1α; a metformina aumenta a degradação da HIF e diminui o recrutamento de DRP-1 pela mitocôndria de células de feocromocitoma; a metformina reduz o consumo de oxigênio nas células PC-12 Adh normais e silenciadas para os genes VHL e SBHB.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).Pheochromocytomas are rare neuroendocrine tumours derived from chromaffin cells of the adrenal medulla. They are responsible for catecholamines synthesis and secretion. The hypersecretion of catecholamines is associated with a high risk of cardiovascular complications. Malignancy and recurrence are rare but still demands effective treatment. Accordingly, the aim of this work was evaluate the effects of metformin on the survival and proliferation of pheochromocytoma cells. The selected methods were: PC12-Adh pheocromocytoma viability evaluated by MTT after treatment of metformin; viability by tripan blue exclusion; proliferation assays with BrDU incorporation; proliferation by violet crystal staining. The western blot was used to evaluate the caspase 3 cleavage; the activity/expression of AMPK/ PTEN/AKT/mTOR/p70S6K/HIF1α partway and the proteasome inhibition. The mRNA of HIF, VEGFA e VEGFR, ADM and ANGP expression were evaluated in pheochromocytoma primary culture by qPCR. Immunofluorescences of KI-67, DAPI e DRP-1 were conducted in PC-12 Adh cells. The determination of O2 consumption was evaluated in PC-12 Adh scramble and VHL and SDHB silencing using a respirometer. A lipid peroxidation assay was performed to evaluate cellular stress. The results show that sunitinib 8μM and metformin 20mM reduced the fibroblast viability in 60% by MTT assay and did not modify in the tripan exclusion assay, however sunitinib and metformin reduced the pheochromocytoma cell viability in 50 and 60% by tripan blue exclusion. The pheochromocytoma cells proliferation was reduced by 40% with a both, sunitinib and metformin and the effect of metformin in pheochromocytoma cells was might acute. Metformin 20mM in 48h reduced the caspase 3 cleavage while sunitinib did not however sunitinib and metformin modified the nucleus structure. Metformin reduced the activation of proteins of the AMPK/PTEN/AKT/mTOR pathway in PC-12 Adh, which suggests impairment of growth and cell proliferation and decreased the VEGFR mRNA levels of pheochromocytoma primary culture. The proteasome of PC-12 Adh was inhibited by metformin treatment, as well as the Drp-1 recruitment by mitochondria. In metformin-treated PC12-Adh PHEO cell, the cellular lipid peroxidation was also increased, and the O2 consumption decreased in the same cells as well as in PC-12 Adh silencing for SDHB and VHL with metformin 10mM. Finally, the results suggest that metformin has a moderate inhibitory effect on the viability of PC12-Adh PHEO cells and in fibroblast cells, and this effect might be acute in pheochromocytoma cells. Moreover, metformin treatment induced the apoptosis and positive modulation of the AMPK/PTEN/AKT/mTOR signaling pathway in PC-12 Adh cells, and modify the activity/expression of mTOR, p70S6K and HIF1α in primary culture. Metformin might modify the mitochondria dynamic and increased the HIF degradation by proteasome. This effect is associated with enhanced lipid peroxidation and decreased O2 consumption by those cells, which are both suggestive of increased cellular stress. Altogether our results corroborate the hypothesis of an inhibitory effect of metformin on PHEO cellular proliferation in vitro.Faculdade de Ciências da Saúde (FS)Departamento de Farmácia (FS FAR)Programa de Pós-Graduação em Ciências FarmacêuticasSimeoni, Luiz AlbertoMeireles, Cinthia Gabriel2021-08-13T13:10:28Z2021-08-13T13:10:28Z2021-08-132018-08-27info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfMEIRELES, Cinthia Gabriel. Estudo do efeito da metformina nas vias de sinalização relacionadas à sobrevivência e proliferação celular em linhagens de Feocromocitoma. 2018. 140 f., il. Tese (Doutorado em Ciências Farmacêuticas)—Universidade de Brasília, Brasília, 2018.https://repositorio.unb.br/handle/10482/41660info:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNB2024-02-05T18:25:44Zoai:repositorio.unb.br:10482/41660Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2024-02-05T18:25:44Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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