Engenharia genética de Saccharomyces cerevisiae para aumento de síntese de ácidos graxos visando produção de biossurfactante

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Silva, Otávio Bravim da
Data de Publicação: 2019
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UnB
Texto Completo: https://repositorio.unb.br/handle/10482/38863
Resumo: Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2019.
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spelling Engenharia genética de Saccharomyces cerevisiae para aumento de síntese de ácidos graxos visando produção de biossurfactanteSaccharomyces cerevisiaeRamnolipídeosBiossurfactantesÁcidos graxosTese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2019.A substituição de dispersantes de origem petroquímica por biossurfactantes é vantajosa por serem moléculas biodegradáveis e não tóxicas. Dentre os biossurfactantes, o ramnolipídeo é atualmente a molécula mais estudada. Estes são produzidos pela bactéria Pseudomonas aeruginosa, um patógeno oportunista com resistência natural a um grande número de antibióticos. Sendo assim o escalonamento da produção de ramnolipídeos em P. aeruginosa é oneroso por requerer inúmeras etapas de purificação. Dessa forma, o desenvolvimento de um organismo a partir de engenharia metabólica pode conduzir ao desenvolvimento de uma tecnologia livre de toxinas e com reduzidas etapas de purificação tornando o processo mais economicamente viável. Para tal, a levedura S. cerevisiae se destaca, pois tem sido amplamente utilizada na indústria alimentar, química e médica, por possuir status GRAS (do inglês Generally Regarded As Safe) e ferramentas genéticas disponíveis. Para produzir uma molécula de ramnolipídeo é necessário produzir o ácido graxo 3-(hidroxialcanoiloxi) ácido alcanóico (HAA) e o açúcar ramnose. Para cumprimento da etapa de produção de HAA, três linhagens de S. cerevisiae foram construídas visando aumentar a síntese de ácidos graxos. A primeira linhagem construída, denominada EMB51 contém os genes do complexo enzimático piruvato desidrogenase (PDHc), a segunda, denominada EMB52, os genes do complexo enzimático acetil-CoA Carboxilase (ACC), e a terceira, denominada EMB53, os genes das enzimas ACP-S- malonil transferase, β-cetoacil-ACP sintase, e β-cetoacil redutase (Fab), que constituem metade da via de síntese de novo de ácidos graxos. Também foi construída uma linhagem controle com o plasmídeo vazio denominada EMB50. Estas linhagens tiveram confirmação da transcrição de seus genes, foram analisadas em processo fermentativo do tipo batelada e analisadas quantitativa e qualitativamente em relação à produção de ácidos graxos através de cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS). As linhagens também tiveram quantificados seus compostos acetil-CoA e malonil-CoA pela técnica de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS). A linhagem EMB51 foi a que mais produziu ácidos graxos, com um aumento de 16% do total. Sua velocidade de crescimento também foi alterada em 25%. A linhagem EMB52 teve a velocidade de crescimento aumentada em 35%, além de um aumento de 6% no total de ácidos graxos. A levedura EMB53 também teve uma velocidade de crescimento 50% maior, mas sem alteração no perfil produtivo de ácidos graxos. Em relação à produção qualitativa de ácidos graxos, a linhagem EMB51 produziu uma quantidade maior de ácidos graxos de cadeia curta (C10-C12), enquanto as linhagens EMB52 e EMB53 tiveram anulação de sua produção no qual foram similares à linhagem controle. Após constatação de que a linhagem EMB51 produzia mais ácidos graxos, especialmente C10 e C12, uma quarta linhagem foi construída pela inserção dos genes do complexo enzimático piruvato desidrogenase, juntamente com os genes de produção de ramnose e ramnolipídeo. Essa levedura teve seu perfil cinético analisado, não tendo uma velocidade de crescimento estatisticamente diferente, mas com sua quantificação de ácidos graxos diminuída em 20% em relação à linhagem controle. Ademais, ao aferir a produção de ramnolipídeos dessa linhagem através da técnica de LC-MS, não foi possível constatar a produção desta molécula. Sendo assim, a maximização da produção de ácidos graxos se mostrou eficiente nas estratégias das linhagens EMB51 e EMB52, porém ao utilizar a expressão de genes codificantes de PDHc juntamente com os de produção de ramnolipídeo não mostraram eficiência para a produção e detecção desta molécula em S. cerevisiae.Surfactants are molecules used in the dispersion of soil and water contaminants. These molecules reduce water’s surface tension by allowing immiscible phases to form an emulsion, aiding oil dispersion. Most of these surfactants are chemically synthesized, however, replacing these petrochemical dispersants with biosurfactants is advantageous because they are biodegradable and non-toxic molecules. Rhamnolipid biosurfactant is currently the most studied molecule. These are produced by the bacterium Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen with natural resistance to a large number of antibiotics and antiseptics. Thus, the staggering of production of rhamnolipids in P. aeruginosa is expensive because it requires numerous purification steps. Thus, the development of an organism from metabolic engineering can lead to the development of a clean technology, free of toxins and with lower purification processes. Aiming this, S. cerevisiae yeast stands out because it already is widely used in the food, chemical and medical industry, as it has Generally Regarded as Safe (GRAS) status and a wide variety of genetic tools available. To produce a rhamnolipid molecule it is necessary to produce 3- (hydroxyalkanoyloxy) alkanoic acid (HAA) fatty acid and rhamnose sugar. To fulfill the HAA production step, three S. cerevisiae strains were constructed by diverting respiratory metabolism to fatty acid synthesis using the pYAC4 vector in its artificial chromosome configuration. The first constructed strain, named EMB51, contains the pyruvate dehydrogenase (PDHc) enzyme complex genes, the second, named EMB52, the acetyl-CoA Carboxylase (ACC) enzyme complex genes, and the third, named EMB53, the ACP-S-malonyl enzyme genes transferase, β-ketoacyl-ACP synthase, and β-ketoacyl reductase (Fab) which constitute half of the de novo fatty acid synthesis pathway. An empty plasmid control strain EMB50 was also constructed. These strains were confirmed by the transcription of their genes, analyzed in batch fermentation process and analyzed quantitatively and qualitatively for fatty acid production by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS). The strains also had their acetyl-CoA and malonyl-CoA compounds quantified by the mass spectrometry coupled to liquid chromatography (LC-MS) technique. These methodologies allowed the characterization of the strains. The EMB51 strain produced the most fatty acids, with an increase of 16% of the total. Its growth rate has also been altered by 25%. The EMB52 strain had its growth speed increased by 35%, in addition to a 6% increase in total fatty acids. The yeast EMB53 also had a growth speed 50% higher, but without alteration in the productive profile of fatty acids. Regarding the qualitative production of fatty acids, the EMB51 strain produced a greater amount of short-chain fatty acids (C10-C12), while the EMB52 and EMB53 strains had their production similar to the control strain. After finding that the EMB51 strain produced more fatty acids, especially C10 and C12, a fourth strain was constructed by inserting the enzyme pyruvate dehydrogenase complex genes, together with the rhamnose and rhamnolipid production genes. This yeast had its kinetic profile analyzed, not having a statistically different growth rate, but with its quantification of fatty acids decreased by 20% in relation to the control strain. Furthermore, when assessing the production of rhamnolipids from this strain using the LC-MS technique, it was not possible to verify the production of this molecule. Thus, the maximization of fatty acid production proved to be efficient for the strategies of the EMB51 and EMB52 strains, however, when using the expression of PDHc coding genes together with those of rhamnolipid production, they did not show efficiency for the production and detection of this molecule in S. cerevisiae.Parachin, Nádia SkorupaSilva, Otávio Bravim da2020-07-03T11:02:42Z2020-07-03T11:02:42Z2020-07-032019-12-10info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfSILVA, Otávio Bravim da. Engenharia genética de Saccharomyces cerevisiae para aumento de síntese de ácidos graxos visando produção de biossurfactante. 2019. xxiii, 88 f., il. Tese (Doutorado em Biologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2019.https://repositorio.unb.br/handle/10482/38863A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições:Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.info:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNB2023-07-08T00:05:37Zoai:repositorio.unb.br:10482/38863Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2023-07-08T00:05:37Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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