Caracterização bioquímica e celular da interação da enzima glutaminase com a enzima glicolítica piruvato quinase M2 : Biochemical and cellular characterization of the interaction of the enzyme glutaminase and the glycolytic enzyme pyruvate kinase M2

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Bastos, Alliny Cristiny da Silva, 1991-
Data de Publicação: 2021
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1641977
Resumo: Orientador: Sandra Martha Gomes Dias
id UNICAMP-30_125f3b0c4e81e6b014851337abad7ae8
oai_identifier_str oai::1166712
network_acronym_str UNICAMP-30
network_name_str Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
repository_id_str
spelling Caracterização bioquímica e celular da interação da enzima glutaminase com a enzima glicolítica piruvato quinase M2 : Biochemical and cellular characterization of the interaction of the enzyme glutaminase and the glycolytic enzyme pyruvate kinase M2Biochemical and cellular characterization of the interaction of the enzyme glutaminase and the glycolytic enzyme pyruvate kinase M2GlutaminasePiruvato quinaseMetabolismoCâncerGlutaminasePyruvate kinaseMetabolismCancerOrientador: Sandra Martha Gomes DiasTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Células neoplásicas compartilham características adquiridas durante o desenvolvimento tumoral essenciais para a progressão do câncer. Particularmente, a reprogramação do metabolismo tumoral é de suma importância para suprir a alta demanda energética e biossintética dessas células. As enzimas glutaminases (GLS) são peça-chave nesse processo. As GLS convertem a glutamina (GLN) em glutamato, que por sua vez, serve de substrato para formação de alfa cetoglutarato, um intermediário do ciclo do Ácido Tricarboxílico (TCA). Assim, a GLN é usada como uma fonte anaplerótica de precursores metabólicos do TCA, permitindo a síntese acelerada de biomoléculas e ganho de agressividade tumoral. Dois genes (GLS e GLS2) expressam quatro isoformas de GLS. Neste trabalho estudamos as variantes de GLS, KGA e GAC, devido a sua importância na progressão de diversos tipos de cânceres. Essas isoformas apresentam estrutura molecular divididas em 3 domínios: domínio glutaminolítico central, domínio N-terminal e C-terminal. No domínio C-terminal da isoforma KGA são encontradas sequências de interação proteína-proteína do tipo ankirin repeats (ANK) e sequências do tipo LXXLL (nuclear receptor box, NRbox), normalmente encontradas em reguladores de fatores de transcrição do tipo receptores nucleares. O domínio C-terminal de GAC, em contrapartida, é menor e desestruturado. Tal estrutura molecular nos leva a crer que as isoformas de GLS interajam com outras proteínas e participem de vias bioquímicas distintas do metabolismo de GLN e potencialmente importantes para o fenótipo tumoral. Estudos de duplo-híbrido em levedura realizados previamente no laboratório identificaram a enzima glicolítica piruvato kinase M2 (PKM2) como um potencial parceiro destas isoformas. Assim, o objetivo deste trabalho foi o de explorar a interação de GAC/KGA com PKM2 e aprofundar na descrição bioquímica dos achados, bem como em linhagens celulares de câncer de mama triplo negativo. Expressamos PKM2 em sistema heterólogo, a purificamos e mostramos por anisotropia de fluorescência que a mesma interage diretamente com GAC com maior afinidade do que com KGA. A formação de filamentos de GAC induzidos pela incubação com fosfato inorgânico leva a perda da interação. Além disso, GAC em excesso molar leva a inibição da atividade de PKM2. A formação de um perfil diferencial de partículas de GAC+PKM2 foi observada por Microscopia Eletrônica, sendo um indicativo da formação do complexo. GAC e PKM2 endógenas e expressas ectopicamente em células de mamíferos co-imunoprecipitaram (Co-IP) e mostraram sinais de co-localização, como revelado por ensaio de Duolink PLA. A remoção de GLN levou a alteração no sinal de fluorescência de GAC para uma marcação filamentosa, ocasionando a perda de seu perfil disperso no citoplasma coerente com marcação mitocondrial na presença de GLN. Apesar dos resultados não mostrarem diretamente a filamentação vista em in vitro, os mesmos são compatívies com estas estruturas. Verificamos que, como visto in vitro, a retirada de GLN do meio de cultivo celular levou a perda de sinal do Duolink e de Co-IP, indicativos de interação. Nossos resultados mostram que PKM2 é parceiro de interação de GAC in vitro e em células e que a interação não é favorecida pela filamentação induzida pela privação de GLN. Além disto, GAC diminui a atividade de PKM2 in vitro, implicando um papel de GAC na regulação da via glicolíticaAbstract: Neoplastic cells share characteristics acquired during tumor development that are essential for cancer progression. In particular, the reprogramming of tumor metabolism is extremely important to meet the high energy and biosynthetic demand of these cells. Glutaminase enzymes (GLS) are key in this process. GLS convert glutamine (GLN) into glutamate, which in turn serves as a substrate for the formation of alpha ketoglutarate, an intermediate in the Tricarboxylic Acid (TCA) cycle. Thus, GLN is used as an anaplerotic source of TCA metabolic precursors, allowing the accelerated synthesis of biomolecules and tumor aggressiveness gain. Two genes (GLS and GLS2) express four GLS isoforms. In this work, we focus in the variants of GLS, KGA and GAC, due to their importance in the progression of several types of cancers. These isoforms have a molecular structure divided into 3 domains: central glutaminolytic domain, N-terminal and C-terminal domain. In the C-terminal domain of KGA are found protein-protein interaction sequences such as ankirin repeats (ANK) and sequences of the LXXLL type (nuclear receptor box, NRbox), normally found in regulators of transcription factors such as nuclear receptors. The C-terminal domain of GAC, by contrast, is smaller and unstructured. Such molecular structure leads us to believe that GLS isoforms interact with other proteins and participate in biochemical pathways distinct from GLN metabolism and potentially important for the tumor phenotype. Yeast double-hybrid studies previously performed in the laboratory identified the glycolytic enzyme pyruvate kinase M2 (PKM2) as a potential partner of these isoforms. Thus, the aim of this work was to explore the interaction of GAC/KGA with PKM2 and deepen the biochemical description of the findings, as well as in triple negative breast cancer cell lines. We express PKM2 in a heterologous system, purify it, and show by fluorescence anisotropy that it interacts directly with GAC with greater affinity than with KGA, and that the formation of GAC filaments larger than tetramers induced by incubation with inorganic phosphate, leads to loss of interaction. Furthermore, molar excess GAC leads to inhibition of PKM2 activity. The formation of a differential profile of GAC+PKM2 particles was observed by Electron Microscopy, being a possible indication of the formation of the complex. Endogenous and ectopically expressed GAC and PKM2 in mammalian cells co-immunoprecipitated (Co-IP) and showed signs of colocalization, as revealed by Duolink PLA assay. Removal of GLN led to a change in the GAC fluorescence signal to a filamentous signal, with a shift in a scattered cytoplasmic profile consistent with mitochondrial signal in the presence of GLN. Although the results do not directly show the filamentation seen in vitro, they are compatible with these structures. We verified that, as seen in vitro, the removal of GLN from the cell culture medium led to loss of Duolink and Co-IP signal, indicative of interaction. Our results show that PKM2 is an interaction partner of GAC in vitro and in cells and the interaction is not favored by filamentation induced by GLN deprivation. Furthermore, GAC decreases PKM2 activity in vitro, implying a role for GAC in regulating the glycolytic pathwayDoutoradoGenética Animal e EvoluçãoDoutora em Genética e Biologia MolecularCNPQ870370/1997-9CAPES88887.145696/2017-00FAPESP15/25832-4[s.n.]Dias, Sandra Martha Gomes, 1975-Ambrosio, Andre Luís BerteliMercaldi, Gustavo FernandoSmetana, Juliana Helena CostaGuido, Rafael Victório CarvalhoUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de BiologiaPrograma de Pós-Graduação em Genética e Biologia MolecularUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASBastos, Alliny Cristiny da Silva, 1991-20212021-05-28T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf1 recurso online (163 p.) : il., digital, arquivo PDF.https://hdl.handle.net/20.500.12733/1641977BASTOS, Alliny Cristiny da Silva. Caracterização bioquímica e celular da interação da enzima glutaminase com a enzima glicolítica piruvato quinase M2: Biochemical and cellular characterization of the interaction of the enzyme glutaminase and the glycolytic enzyme pyruvate kinase M2. 2021. 1 recurso online (163 p.) Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1641977. Acesso em: 3 set. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/1166712Requisitos do sistema: Software para leitura de arquivo em PDFporreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2021-09-20T14:35:26Zoai::1166712Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2021-09-20T14:35:26Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
dc.title.none.fl_str_mv Caracterização bioquímica e celular da interação da enzima glutaminase com a enzima glicolítica piruvato quinase M2 : Biochemical and cellular characterization of the interaction of the enzyme glutaminase and the glycolytic enzyme pyruvate kinase M2
Biochemical and cellular characterization of the interaction of the enzyme glutaminase and the glycolytic enzyme pyruvate kinase M2
title Caracterização bioquímica e celular da interação da enzima glutaminase com a enzima glicolítica piruvato quinase M2 : Biochemical and cellular characterization of the interaction of the enzyme glutaminase and the glycolytic enzyme pyruvate kinase M2
spellingShingle Caracterização bioquímica e celular da interação da enzima glutaminase com a enzima glicolítica piruvato quinase M2 : Biochemical and cellular characterization of the interaction of the enzyme glutaminase and the glycolytic enzyme pyruvate kinase M2
Bastos, Alliny Cristiny da Silva, 1991-
Glutaminase
Piruvato quinase
Metabolismo
Câncer
Glutaminase
Pyruvate kinase
Metabolism
Cancer
title_short Caracterização bioquímica e celular da interação da enzima glutaminase com a enzima glicolítica piruvato quinase M2 : Biochemical and cellular characterization of the interaction of the enzyme glutaminase and the glycolytic enzyme pyruvate kinase M2
title_full Caracterização bioquímica e celular da interação da enzima glutaminase com a enzima glicolítica piruvato quinase M2 : Biochemical and cellular characterization of the interaction of the enzyme glutaminase and the glycolytic enzyme pyruvate kinase M2
title_fullStr Caracterização bioquímica e celular da interação da enzima glutaminase com a enzima glicolítica piruvato quinase M2 : Biochemical and cellular characterization of the interaction of the enzyme glutaminase and the glycolytic enzyme pyruvate kinase M2
title_full_unstemmed Caracterização bioquímica e celular da interação da enzima glutaminase com a enzima glicolítica piruvato quinase M2 : Biochemical and cellular characterization of the interaction of the enzyme glutaminase and the glycolytic enzyme pyruvate kinase M2
title_sort Caracterização bioquímica e celular da interação da enzima glutaminase com a enzima glicolítica piruvato quinase M2 : Biochemical and cellular characterization of the interaction of the enzyme glutaminase and the glycolytic enzyme pyruvate kinase M2
author Bastos, Alliny Cristiny da Silva, 1991-
author_facet Bastos, Alliny Cristiny da Silva, 1991-
author_role author
dc.contributor.none.fl_str_mv Dias, Sandra Martha Gomes, 1975-
Ambrosio, Andre Luís Berteli
Mercaldi, Gustavo Fernando
Smetana, Juliana Helena Costa
Guido, Rafael Victório Carvalho
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
dc.contributor.author.fl_str_mv Bastos, Alliny Cristiny da Silva, 1991-
dc.subject.por.fl_str_mv Glutaminase
Piruvato quinase
Metabolismo
Câncer
Glutaminase
Pyruvate kinase
Metabolism
Cancer
topic Glutaminase
Piruvato quinase
Metabolismo
Câncer
Glutaminase
Pyruvate kinase
Metabolism
Cancer
description Orientador: Sandra Martha Gomes Dias
publishDate 2021
dc.date.none.fl_str_mv 2021
2021-05-28T00:00:00Z
dc.type.status.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.type.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
format doctoralThesis
status_str publishedVersion
dc.identifier.uri.fl_str_mv https://hdl.handle.net/20.500.12733/1641977
BASTOS, Alliny Cristiny da Silva. Caracterização bioquímica e celular da interação da enzima glutaminase com a enzima glicolítica piruvato quinase M2: Biochemical and cellular characterization of the interaction of the enzyme glutaminase and the glycolytic enzyme pyruvate kinase M2. 2021. 1 recurso online (163 p.) Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1641977. Acesso em: 3 set. 2024.
url https://hdl.handle.net/20.500.12733/1641977
identifier_str_mv BASTOS, Alliny Cristiny da Silva. Caracterização bioquímica e celular da interação da enzima glutaminase com a enzima glicolítica piruvato quinase M2: Biochemical and cellular characterization of the interaction of the enzyme glutaminase and the glycolytic enzyme pyruvate kinase M2. 2021. 1 recurso online (163 p.) Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1641977. Acesso em: 3 set. 2024.
dc.language.iso.fl_str_mv por
language por
dc.relation.none.fl_str_mv https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/1166712
Requisitos do sistema: Software para leitura de arquivo em PDF
dc.rights.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/openAccess
eu_rights_str_mv openAccess
dc.format.none.fl_str_mv application/pdf
1 recurso online (163 p.) : il., digital, arquivo PDF.
dc.publisher.none.fl_str_mv [s.n.]
publisher.none.fl_str_mv [s.n.]
dc.source.none.fl_str_mv reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
instacron:UNICAMP
instname_str Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
instacron_str UNICAMP
institution UNICAMP
reponame_str Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
collection Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
repository.name.fl_str_mv Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
repository.mail.fl_str_mv sbubd@unicamp.br
_version_ 1809189175958700032