Análises evolutiva, estrutural e mecanística da arquitetura multidomínio das glutaminases humanas e estudo da interação entre glutaminases e o receptor ativado por proliferadores de peroxissomo gama

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Pasquali, Camila Cristina, 1989-
Data de Publicação: 2017
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1634291
Resumo: Orientador: Andre Luís Berteli Ambrosio
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Com base na construção filogenética, propusemos que a arquitetura multidomínios de glutaminases é uma característica herdada de ancestrais bacterianos. Também propusemos um modelo evolutivo no qual o surgimento da isoforma mais ativa, glutaminase C (GAC), foi um evento tardio de retrotransposição, ocorrido em Chondrichthyes. As repetições de anquirina (ANK) foram adquiridas no início do processo evolutivo. Para obter informações a respeito do enovelamento do domínio ANK, resolvemos a estrutura cristalográfica da porção C-terminal de kidney-type glutaminase (KGA). Além disso, resolvemos a estrutura cristalina de KGA completa, contendo os três domínios N-terminal, catalítico e C-terminal. Estas estruturas explicam a capacidade reduzida desta isoforma em formar filamentos supra-tetraméricos cataliticamente ativos previamente observados em GAC. Considerando a presença de motivos de interação proteína-proteína, como ANK e Nuclear Receptor (NR) boxes, investigamos a interação de KGA com outras proteínas. O Receptor Ativado por Proliferadores de Peroxissomo gama (PPAR?) já havia sido identificado em nosso grupo como parceiro de KGA por duplo-híbrido em levedura. Neste trabalho, determinamos que o domínio de ligação aos ligantes de PPAR? e os domínios N-terminal e catalítico de KGA são suficientes para a interação. KGA apresentou afinidade relativamente baixa com o receptor, com constantes de dissociação aparentes da ordem de micromolar, indicativo de interação fraca e transiente. A superexpressão de KGA resultou em aumento na atividade transcricional de PPAR?, tanto em célula não tumoral (HEK-293T) quanto tumoral (MDA-MB-436). Coletivamente, estes resultados contribuem para o entendimento das diferenças entre as múltiplas glutaminases de mamíferos, podendo auxiliar no desenho de inibidores isoforma-específicos para o tratamento do câncer e de outras doençasAbstract: On the basis of the detection of tissue-specific enzyme activity and inhibition by catalytic products, Hans Krebs first demonstrated the existence of multiple glutaminases in mammals. Currently, 2 human genes are known to encode at least 4 glutaminase isoforms. In this work, we investigated the origin and evolution of the glutaminases. We built a phylogenetic tree, and propose that the multidomain architecture of glutaminases is a feature inherited from bacterial ancestors. We also propose an evolutionary model wherein the appearance of the most active enzyme isoform, glutaminase C (GAC), which is expressed in many cancers, was a late retro transposon event that occurred in fishes from the Chondrichthyes class. The ankyrin (ANK) repeats in the glutaminases were acquired early in the evolutionary process. To obtain information on ANK folding, we solved the high-resolution structure of the ANK repeat- containing C-termini of kidney-type glutaminase (KGA). We also solved the novel crystal structure of multidomain KGA, containing N-terminal, glutaminase and C-terminal domains. The structures explain these proteins¿ compromised ability to assemble into catalytically active supra-tetrameric filaments, as previously shown for GAC. Considering the presence of protein-protein interaction domains, such as ANK and Nuclear Receptor (NR) boxes, we investigated the interaction of KGA with other proteins. The Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma (PPAR?) was previously identified in our group as interaction partner of KGA using yeast two-hybrid approach. In this work, we determined that the Ligand Binding Domain (LBD) PPAR? and both N-terminal and glutaminase domains of KGA are sufficient for mediating the interaction. KGA showed a relatively low affinity with the receptor. The apparent dissociation constants experimentally calculated fall into micromolar range and are indicative of a weak and transient interaction. Moreover, non tumoral (HEK-293T) and tumoral (MDA-MB-436) cells overexpressing KGA showed an increase of the transcriptional activity of PPAR?. Collectively, these results provide information about glutaminases that will aid in the design of isoform-oriented glutaminase inhibitorsDoutoradoFármacos, Medicamentos e Insumos para SaúdeDoutora em CiênciasFAPESP2014/19518-2, 2013/01540-9[s.n.]Ambrosio, Andre Luís Berteli, 1978-Navarro, Marcos Vicente de Albuquerque SallesNascimento, Alessandro SilvaSmetana, Juliana Helena CostaCordeiro, Artur TorresUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de BiologiaPrograma de Pós-Graduação em Biociências e Tecnologia de Produtos BioativosUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASPasquali, Camila Cristina, 1989-20172017-07-14T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf1 recurso online (130 p.) : il., digital, arquivo PDF.https://hdl.handle.net/20.500.12733/1634291PASQUALI, Camila Cristina. Análises evolutiva, estrutural e mecanística da arquitetura multidomínio das glutaminases humanas e estudo da interação entre glutaminases e o receptor ativado por proliferadores de peroxissomo gama. 2017. 1 recurso online (130 p.) Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1634291. 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