Clonagem, expressão, purificação e caracterização da proteína Hsp110 de sorgo visando a compreensão do sistema de desagregação de proteínas em plantas

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Franco, Juliana Crotti, 1990-
Data de Publicação: 2018
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1636171
Resumo: Orientador: Carlos Henrique Inacio Ramos
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spelling Clonagem, expressão, purificação e caracterização da proteína Hsp110 de sorgo visando a compreensão do sistema de desagregação de proteínas em plantasCloning, expression, purification and characterization of sorghum Hsp110 protein to understanding the protein disaggregation system in plantsChaperonas molecularesProteínas de choque térmicoMolecular chaperonesHeat shock proteinsOrientador: Carlos Henrique Inacio RamosDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de QuímicaResumo: A chaperona Hsp100, que está presente desde bactérias até plantas, mas não em metazoários, tem a importante função de desagregase, auxiliando proteínas a serem recuperadas e reenoveladas. Estudos recentes sugeriram que, em células animais, a co-chaperona Hsp110 coopera com a Hsp70 em um eficiente sistema de desagregação. Como plantas expressam tanto a Hsp100 quanto a Hsp110, nos perguntamos se a Hsp110 poderia ser parte de um sistema de desagregação adicional neste organismo (no caso sorgo), uma vez que plantas enfrentam condições estressantes mais severas do que os animais. Tendo identificado o gene para esta proteína em sorgo utilizou-se o sistema pET de expressão em células de E. coli e purificação usando cromatografia de afinidade em níquel seguida de cromatografia de exclusão molecular. Uma combinação de técnicas espectroscópicas e hidrodinâmicas foi utilizada para a caracterização da conformação da proteína, enquanto que experimentos envolvendo proteção contra agregação e ensaios de reenovelamento e desagregação de substratos modelo foram utilizados para a caracterização funcional. O gene foi clonado e a proteína foi expressa solúvel, sendo que após purificação verificou-se que a mesma foi produzida enovelada (cerca de 40 % da sua cadeia polipeptídica encontra-se na forma de hélice ?) e estável, mantendo estrutura secundária até 48 °C e aproximadamente 2 mol L-1 de ureia. Medidas hidrodinâmicas indicaram que a proteína é um monômero alongado com massa molecular de 98 kDa (sendo o valor esperado pela sequência de 95,23 kDa). A Hsp110 mostrou também ser funcional ao apresentar atividade chaperona e ser capaz de, em conjunto com outras proteínas do sistema Hsp70, reenovelar e desagregar o substrato modelo testado. Estes resultados apoiam a hipótese de que plantas possuem mais de um sistema capaz de atuar na desagregação de proteínas aumentando seu poder de tolerar os diversos tipos de estresse a que estão expostasAbstract: The Hsp100 chaperone, which is present from bacteria to plants, but is not found in metazoa, has the important function of disaggregase, aiding proteins to be recovered and refolded. Recent studies have suggested that in animal cells, the co-chaperone Hsp110 cooperates with Hsp70 in an efficient disaggregation system. As plants express both Hsp100 and Hsp110, we wondered whether Hsp110 could be part of an additional disaggregation system in this organism (sorghum in this case), since plants face more severe stressing conditions than animals. The hsp110 gene was identified in sorghum and the expression pET system was transformed in E. coli cells and the protein purified using nickel affinity chromatography followed by molecular exclusion chromatography. A combination of spectroscopic and hydrodynamic techniques was used to characterize protein conformation, while experiments involving protection against aggregation and assays of refolding and disaggregation of model substrates were used for the functional characterization. The protein was expressed soluble, and after purification it was found that it was produced folded (about 40 % of its polypeptide chain is in ? helix form) and stable, maintaining secondary structure up to 48 °C or in approximately 2 mole L-1 of urea. Hydrodynamic measurements indicated that the protein is an elongated monomer with a molecular mass of 98 kDa (expected value from sequence is 95.23 kDa). Hsp110 was also functional since it showed chaperone activity and was able, together with other proteins of the Hsp70 system, to refold and disaggregate a tested model substrate. These results support the hypothesis that plants have more than one system capable of acting in the disaggregation of proteins increasing their power to tolerate the different types of stress to which they are exposedMestradoQuímica OrgânicaMestra em QuímicaFAPESP2016/02137-1[s.n.]Ramos, Carlos Henrique Inacio, 1967-Gozzo, Fábio CesarKobarg, JörgUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de QuímicaPrograma de Pós-Graduação em QuímicaUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASFranco, Juliana Crotti, 1990-20182018-03-22T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdf1 recurso online (103 p.) : il., digital, arquivo PDF.https://hdl.handle.net/20.500.12733/1636171FRANCO, Juliana Crotti. Clonagem, expressão, purificação e caracterização da proteína Hsp110 de sorgo visando a compreensão do sistema de desagregação de proteínas em plantas. 2018. 1 recurso online (103 p.) Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1636171. Acesso em: 3 set. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/1088471Requisitos do sistema: Software para leitura de arquivo em PDFporreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2019-05-31T11:16:55Zoai::1088471Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2019-05-31T11:16:55Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
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