Clonagem, expressão, purificação e caracterização da heat shock protein beta 8 (HspB8) de Aedes aegypti

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Silva, Diego Rocha, 1991-
Data de Publicação: 2018
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1637815
Resumo: Orientador: Carlos Henrique Inacio Ramos
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spelling Clonagem, expressão, purificação e caracterização da heat shock protein beta 8 (HspB8) de Aedes aegyptiCloning, expression, purification and characterization of heat shock protein beta 8 from Aedes aegyptiChaperonas molecularesProteínas de choque térmicoProteínas de choque térmico pequenasMolecular chaperonesHeat shock proteinsHeat-shock proteins, SmallOrientador: Carlos Henrique Inacio RamosDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Chaperonas moleculares são um grupo de proteínas fundamentais para a manutenção da homeostase proteica celular. Estas ajudam outras proteínas a se enovelarem corretamente e sendo classificadas como holders, foldases ou desagrases, de acordo com a função específica. As small heat shock proteins (sHsps) são uma família de chaperonas moleculares as quais atuam como holders, ou seja, têm a capacidade de se ligar a proteínas clientes parcialmente enoveladas, impedindo sua agregação. Neste trabalho, visamos investigar, obtendo parâmetros hidrodinâmicos e ensaios funcionais, a proteína HspB8, uma sHsp de Aedes aegypti, um transmissor dos vírus Zika (ZIKV), Dengue (DENV), Chikungunya (CHIKV) e Febre Amarela. (YFV). Em humanos, camundongos e em Drosophila melanogaster sabe-se que a HspB8 desempenha um papel essencial para a manutenção de importantes funções celulares e a sua desregulação tem relação com doenças neurodegenerativas e câncer. O gene para a expressão da HspB8 foi clonado em vetor pET28a e a proteína foi expressa em Escherichia coli BL21. Os procedimentos de purificação da HspB8 consistiram em uma cromatografia de afinidade ao níquel e, em seguida, uma cromatografia de exclusão por tamanho e a proteína foi obtida com elevado grau de pureza. Experimentos de espectropolarimetria de dicroísmo circular mostraram que a proteína foi produzida enovelada e foi estável até 40 °C. A proteína em estudo contém 27% de conteúdo ?-helicoidal. Além disso, os testes feitos usando cromatografia de exclusão por tamanho acoplada a espalhamento de luz multi-ângulo (SEC-MALS) e espalhamento de luz dinâmico (DLS), mostrou que a HspB8 comportou-se como um monômero não esférico com massa molecular de 24 kDa, tendo raio hidrodinâmico de 33 Å e um coeficiente de difusão de aproximadamente 6,3 cm² s-1. A HspB8 foi capaz de proteger diversas proteínas contra agregação inclusive contra a formação de fibrilas do tipo amiloide em experimentos com 'alfa'-sinucleína humana. Os resultados aqui apresentados trazem informações importantes e inovadoras para um melhor entendimento das sHsps, visto que, a AaHspB8 se apresenta com características conformacionais que diferem das tradicionais para esta classe de proteínasAbstract: Molecular chaperones are a group of proteins that are essential for the maintenance of cellular protein homeostasis by helping other proteins to reach the correct folding. Chaperones can be classified as holders, foldases or disaggregases according to the specific function. Small heat shock proteins (sHsps) are a family of molecular chaperones that act as holders, binding to partially folded proteins preventing their aggregation. In this work, we aimed to investigate the structure and function of a sHsp from Aedes aegypti named AaHspB8. Aedes aegypti is the vector for Zika (ZIKV), Dengue (DENV), Chikungunya (CHIKV) and Yellow Fever viruses (YFV). In humans, mice and in Drosophila melanogaster it is known that HspB8 plays an essential role for the maintenance of important cellular functions and their deregulation is related to neurodegenerative diseases and cancer. The gene for AaHspB8 was cloned into pET28a vector and the protein was expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) strain. The procedures for purification consisted of a nickel affinity chromatography and a size exclusion chromatography, respectively, and the protein was 95% pure. Circular dichroism spectropolarimetry experiments showed that the protein was 27% alpha-helical and stable at 40 °C. In addition, tests performed using size exclusion chromatography coupled to multi-angle light scattering (SEC-MALS) and dynamic light scattering (DLS) showed that AaHspB8 was a non-spherical monomer with 24 kDa, having a hydrodynamic radius of 33 Å and a diffusion coefficient of approximately 6.3 x 10-7 cm² s-1. AaHspB8 was able to protect several proteins against aggregation including the formation of amyloid-like fibrils in experiments with human alpha-synuclein. The results presented here provide important and innovative information for a better understanding of sHsps, since AaHspB8 presents with conformational characteristics that differ from the traditional ones for this class of proteinsMestradoBioquímicaMestre em Biologia Funcional e MolecularCNPQ370470/2016-8[s.n.]Ramos, Carlos Henrique Inacio, 1967-Oliveira, Juliana Ferreira deKobarg, JörgUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de BiologiaPrograma de Pós-Graduação em Biologia Funcional e MolecularUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASSilva, Diego Rocha, 1991-20182018-09-19T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdf1 recurso online (89 p.) : il., digital, arquivo PDF.https://hdl.handle.net/20.500.12733/1637815SILVA, Diego Rocha. Clonagem, expressão, purificação e caracterização da heat shock protein beta 8 (HspB8) de Aedes aegypti. 2018. 1 recurso online (89 p.) Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1637815. Acesso em: 3 set. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/1096406Requisitos do sistema: Software para leitura de arquivo em PDFporreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2020-01-03T11:23:41Zoai::1096406Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2020-01-03T11:23:41Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
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