Impacto das alterações físico-químicas em isolado proteico do soro de leite por proteólise e tratamento com transglutaminase no gosto amargo e na capacidade de sensibilização "in vivo" : Impact of physicochemical changes in whey protein isolate by proteolysis and transglutaminase treatment in bitterness and sensitizing capacity "in vivo"

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Carvalho, Natália Caldeira de, 1986-
Data de Publicação: 2018
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1633951
Resumo: Orientador: Flavia Maria Netto
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Os epítopos conformacionais são facilmente destruídos durante a hidrólise. No entanto, epítopos lineares podem ainda sobreviver ao processo, o que resulta em antigenicidade residual em hidrolisados proteicos. Além disso, a hidrólise de proteínas extensiva leva à liberação de peptídeos com gosto amargo. A combinação de hidrólise enzimática e tratamento com transglutaminase (TG) é uma estratégia promissora para diminuir a antigenicidade de proteínas do leite e o gosto amargo normalmente presente nos hidrolisados. Este estudo avaliou as alterações físico-químicas em isolado proteico do soro de leite (IPS) induzidas pela hidrólise com Alcalase seguida por tratamento com TG e se investigou o impacto no gosto amargo e na antigenicidade dos peptídeos. As hidrólises foram realizadas sob condição sem controle de pH a fim de simular a condição empregada na indústria. Para isto, o impacto da hidrólise conduzida sob condições de pH controlada ou não, utilizando diferentes concentrações de substrato (S%, 3 ou 7% de proteína) e relações enzima:substrato (E/S, 50 ou 100 U g-1), na antigenicidade dos hidrolisados foi investigado. O pH diminuiu de 8,5 para 7,0 nos 15 primeiros minutos das hidrólises sem controle de pH e se manteve constante até o final da reação. A redução no pH não alterou significativamente o grau de hidrólise (GH) dos hidrolisados obtidos com e sem controle de pH, utilizando as mesmas S% e E/S. O GH diminuiu com o aumento do S%, enquanto o aumento da E/S elevou ligeiramente o GH dos hidrolisados. As diferentes condições de pH e S% resultaram em distintos perfis de hidrofilicidade (CLAE-FR) e distribuição de massa molecular (MM) entre os hidrolisados, indicando mudanças no padrão de hidrólise da Alcalase em função desses parâmetros. Essas diferenças refletiram no comportamento de agregação e conformação espacial dos peptídeos, e nas concentrações de ß-Lg e ?-La, detectadas por kits comerciais de ELISA. Os resultados de ELISA e immunoblotting indicaram que a hidrólise diminuiu a capacidade dos hidrolisados de se ligarem às IgE e IgG anti-?-La e anti-ß-Lg, não havendo diferenças significativas entre aqueles obtidos com e sem controle de pH. Todavia, os hidrolisados obtidos sem controle de pH apresentaram maior capacidade de ligação às IgE e IgG anti-BSA, devido à presença de BSA intacta e/ou a liberação de epítopos pelo processo de hidrólise. Diante disso, o estudo prosseguiu usando a hidrólise sem controle de pH, e ultrafiltração usando membrana de corte de 5,0 kDa para a separação da BSA intacta e parcialmente hidrolisada. Os filtrados obtidos foram tratados com TG, sendo avaliado o gosto amargo e antigenicidade. Após o tratamento com TG, houve aumento de 1,5 e 3,0% na proporção de peptídeos entre 1,4 e 3,5 kDa, alterações no perfil cromatográficos, em especial na intensidade dos picos na região de alta e média hidrofilicidade e desaparecimento de um pico na região de baixa hidrofilicidade (CLAE-FR) e na conformação espacial dos peptídeos, confirmada pelos espectros de fluorescência. As alterações no perfil de peptídeos dos filtrados tratados com TG também foram observadas através dos espectros de massas (MALDI-MS), nos quais não foram mais detectados íons com m/z entre 1600 e 3000. Apesar dessas alterações, não ocorreu redução na intensidade e/ou persistência do gosto amargo dos filtrados tratados com TG. A hidrólise seguida pela ultrafiltração, associada ou não à TG, foi capaz de diminuir significativamente a capacidade do IPS de se ligar às IgE específicas. O HF7, tratado ou não com TG, não induziu a produção de IgE e IgG1 específicas em camundongos sensibilizados. A TG não exerceu efeito adicional na redução da capacidade de ligação às IgE específicas ou de sensibilização dos filtrados. Portanto, a hidrólise do IPS com Alcalase seguida pela ultrafiltração mostra-se uma alternativa em potencial para a produção de hidrolisados hipoalergênicos, de acordo com os critérios estabelecidos pela American Academy of Pediatrics para a avaliação da hipoalergenicidade de novas fórmulasAbstract: Enzymatic hydrolysis is widely used method to destroy epitopes, a part of protein capable to induce the production of specific antibodies and to bind to them eliciting allergic response. Conformational epitopes collapse during hydrolysis, while linear epitopes may survive the process, leading to residual antigenicity in protein hydrolysates. Moreover the extensive hydrolysis of proteins releases bitter peptides. The combination of enzymatic hydrolysis and transglutaminase (TG) treatment is a promising strategy to reduce the protein antigenicity and bitter taste often associated with protein hydrolysates. This study evaluated the physicochemical changes in whey protein isolate (WPI) caused by hydrolysis using Alcalase and TG-treatment and on bitter taste and protein antigenicity, including IgE-binding response and ability to sensitize animal model. The hydrolysis reactions were performed under uncontrolled pH condition in order to simulate conditions used in food industry. For that, the impact of hydrolysis performed with or without pH control, using different substrate concentration (S%, 3 or 7% of protein) and enzyme:substrate ratio (E/S, 50 or 100 U g-1), on antigenicity of the hydrolysates was investigated. The pH dropped from 8.5 to 7.0 within the first 15 min of hydrolysis without pH control, and remained constant until the end of reaction. The decrease in pH did not significantly affect the degree of hydrolysis (DH) of the hydrolysates obtained with and without pH control, under the same S% and E/S parameters conditions. The DH decreased with increasing S%, whereas the increase in E/S slightly raised the DH of the hydrolysates. The different condition of pH and S% resulted in different hydrophilicity profiles (RP-HPLC) and molecular mass (MM) distribution among hydrolysates, indicating changes in the cleavage pattern of Alcalase. These differences resulted in different aggregation behavior and spatial conformation of the peptides, and different concentrations of ß-Lg and ?-La detected by commercial ELISA kits. The ELISA and immunoblotting results indicated that the hydrolysis with Alcalase reduced the binding capacity of hydrolysates to anti-ß-Lg and anti-?-La IgE and IgG and no differences were observed among hydrolysates obtained with and without pH control. However, the hydrolysates obtained uncontrolled pH showed increase reactivity to anti-BSA IgE and IgG, due to the presence of intact BSA and/or releasing of epitopes. Therefore the study continued with the hydrolysates obtained under uncontrolled pH, which were ultrafiltered, using a 5.0 kDa cutoff membrane, in order to separate unhydrolysed and partially hydrolyzed BSA. The filtrates were treated with TG and bitter taste and antigenicity were assessed. After TG-treatment, the filtrates showed 1.5 and 3.0% increasing in the amount of peptides between 1.4 and 3.5 kDa, changes in chromatographic profile, especially in peaks intensity in the regions of high and medium hydrophilicity and disappearance of a peak in the region of low hydrophilicity (PR-HPLC) and spatial conformation of the peptides, confirmed by fluorescence spectra. Changes in peptide profile of the filtrates treated with TG were also observed through mass spectra (MALDI-MS), in which ions at m/z in the range of 1600 to 3000 were no longer detected. Despite these changes, no difference was observed in the intensity or perception of bitter taste in the filtrates after TG treatment. The hydrolysis with Alcalase followed by ultrafiltration, associated or not with TG, reduced significantly the binding capacity of WPI to specific IgE. The HF7 treated or not with TG did not generate specific IgE and IgG1 in mouse model of allergy. TG had no further effect in reducing of IgE-binding capacity or ability to induce sensitization of the filtrates. Therefore, hydrolysis of WPI with Alcalase followed by ultrafiltration can be a potential alternative to produce hypoallergenic hydrolysates, according to established criteria by American Academy of Pediatrics to determine hypoallergenicity of new formulasDoutoradoNutrição Experimental e Aplicada à Tecnologia de AlimentosDoutora em Alimentos e NutriçãoCAPESFAPESP2015/26586-7[s.n.]Netto, Flavia Maria, 1957-Tavares, Guilherme MirandaVillas Boas, Mariana BattaglinSimioni, Patricia UcelliBrazaca, Solange Guidolin CanniattiUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Engenharia de AlimentosPrograma de Pós-Graduação em Alimentos e NutriçãoUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASCarvalho, Natália Caldeira de, 1986-20182018-02-07T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf1 recurso online (140 p.) : il., digital, arquivo PDF.https://hdl.handle.net/20.500.12733/1633951CARVALHO, Natália Caldeira de. Impacto das alterações físico-químicas em isolado proteico do soro de leite por proteólise e tratamento com transglutaminase no gosto amargo e na capacidade de sensibilização "in vivo": Impact of physicochemical changes in whey protein isolate by proteolysis and transglutaminase treatment in bitterness and sensitizing capacity "in vivo". 2018. 1 recurso online (140 p.) Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1633951. 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