Caracterização de uma nova isoforma da enzima COMT associada à DTM

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Meloto, Carolina Beraldo, 1983-
Data de Publicação: 2013
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1619493
Resumo: Orientador: Célia Marisa Rizzatti Barbosa
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spelling Caracterização de uma nova isoforma da enzima COMT associada à DTMCharacterization of a new COMT isoform associated with TMDTranstornos da articulação temporomandibularPolimorfismo de nucleotídeo únicoRNA mensageiroTemporomandibular joint disordersPolymorphism single nucleotideRNA messengerOrientador: Célia Marisa Rizzatti BarbosaTese (Doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de PiracicabaResumo: Catecolamina-O-metiltransferase (COMT) é uma enzima com amplas funções biológicas, inclusive a modulação da dor, exercidas através da metabolização de substratos como a dopamina, adrenalina, e noradrenalina. Já é sabido que a atividade da COMT é geneticamente polimórfica em humanos, e se correlaciona com a percepção individual da dor e eficiência na sua remissão entre pacientes com disfunção temporomandibular (DTM) tratados com propranolol. Por isso, nosso primeiro objetivo foi investigar novos polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) que pudessem marcar para este benefício. De fato, encontramos um novo SNP, rs165774 (G>A), que se mostrou associado à DTM ou fenótipos intermediários em duas coortes diferentes. Este polimorfismo, por sua vez, se localiza em proximidade a um segundo SNP, rs165895 (T>C), ambos na região 3' não traduzida (3'UTR) de um mRNA alternativo da COMT ainda não caracterizado. Assim, também foi nossos objetivos (i) verificar a expressão deste transcrito em diferentes tecidos humanos e linhas de células, rastreando-o por RT-PCR (Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction); (ii) predizer a estrutura cristalina da enzima codificada por ele, através de modelagem pelo método dinâmico molecular discreto; (iii) expressá-lo em um sistema celular e comparar sua expressão relativa e atividade enzimática às da isoforma convencional, determinando-as por RT-PCR e HPLC (High Performance Liquid Chromatography), respectivamente; e (iv) verificar os efeitos dos SNPs rs165774 e rs165895 sobre este transcrito, criando-se diferentes mutantes por mutação sítio-dirigida e observando seus efeitos sobre a expressão relativa e atividade enzimática. Nossos resultados mostraram que (i) o transcrito alternativo da COMT é expresso em diferentes tecidos humanos e sistemas celulares; (ii) a estrutura cristalina de sua enzima exibe uma região C-terminal único que é distinta da isoforma convencional; e que este transcrito é (iii) menos relativamente expresso e sua enzima menos ativa que o transcrito e a enzima convencionais, respectivamente, e (iv) sofre regulação em nível transcricional pelos SNPs rs165774 e rs165895. Com este estudo, pudemos concluir que o SNP rs165774 é um forte marcador genético para DTM; que juntamente com o SNP rs165895, localizam-se na região 3'UTR de uma forma alternativa de mRNA da COMT que, pela primeira vez, provou ser capaz de codificar para uma isoforma alternativa da enzima que exibe atividade enzimática; e que esta isoforma alternativa de mRNA da COMT sofre efeitos regulatórios, em nível transcricional, causados por ambos os SNPsAbstract: Catecolamine-O-methyltransferase (COMT) is an enzyme with broad biological functions, including pain modulation, exerted through metabolization of substrates such as dopamine, epinephrine, and norepinephrine. It is well known that COMT activity is genetically polymorphic in humans, and correlates to individual pain perception and efficiency in its remission among temporomandibular disorder (TMD) patients treated with propranolol. Thus, our first aim was to investigate new single nucleotide polymorphism (SNP) that might mark for this benefit. Indeed, we have found a new SNP, rs165774 (G>A), that was associated with TMD or intermediate phenotypes in two different cohorts. This polymorphism, in turn, is in close proximity to a second SNP, rs165895 (T>C), both in the 3' untranslated region (3'UTR) of an alternative COMT mRNA that has not yet been characterized. Therefore, we also aimed to (i) verify the expression of this transcript in different human tissues and cell systems, tracking it through RT-PCR (Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction); (ii) predict the crystalline structure of the enzyme encoded by it, modeling it with discrete molecular dynamics; (iii) express it in a cell system and compare its relative expression and enzymatic activity to the conventional isoform, using RT-PCR and HPLC (High Performance Liquid Chromatography), respectively; and (iv) verify the effects of SNPs rs165774 and rs165895 on the transcript, creating different mutants by site-directed mutagenesis and observing their effects on the relative expression and enzymatic activity. Our findings show that (i) the alternative COMT transcript is expressed in different human tissues and cell systems; (ii) the crystalline structure of its enzyme exhibits a unique C-terminus that is distinct from the conventional isoform; and that this transcript is (iii) less relatively expressed and its enzyme is less active than the conventional transcript and enzyme, respectively, and (iv) is regulated, at transcriptional level, by the SNPs rs165774 e rs165895. With this study, we conclude that SNP SNPs rs165774 is a strong genetic marker for TMD; that along with SNPs rs165895, they are located in the 3'UTR of an alternative COMT mRNA which proved, for the first time, to be able of encoding an alternative isoform of the enzyme that exhibits enzymatic activity; and that this alternative COMT mRNA is regulated, at transcriptional level, by both SNPsDoutoradoPrótese DentalDoutora em Clínica Odontológica[s.n.]Rizzatti-Barbosa, Celia Marisa, 1957-Bussadori, Cinara Maria CamparisSerrano, Priscila de OliveiraDel Bel Cury, Altair AntoninhaLine, Sergio Roberto PeresUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Odontologia de Piracicaba (FOP)Programa de Pós-Graduação em Clínica OdontológicaUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASMeloto, Carolina Beraldo, 1983-2013info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf101 p. : il.https://hdl.handle.net/20.500.12733/1619493MELOTO, Carolina Beraldo. Caracterização de uma nova isoforma da enzima COMT associada à DTM. 2013. 101 p. Tese (Doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba, Piracicaba, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1619493. Acesso em: 3 set. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/901690porreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2017-10-27T16:00:38Zoai::901690Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2017-10-27T16:00:38Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
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