Expressão heteróloga de enzimas hipertermofílicas em "Aspergillus nidulans"

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Gerhardt, Jaqueline Aline, 1990-
Data de Publicação: 2018
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1634511
Resumo: Orientador: André Ricardo de Lima Damásio
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spelling Expressão heteróloga de enzimas hipertermofílicas em "Aspergillus nidulans"Heterologous expression of hypethermophilic enzymes in "Aspergillus nidulans"Expressão heterólogaAspergillus nidulansEnzimasGlicosídeo hidrolasesHeterologous expressionAspergillus nidulansEnzymesGlycoside hydrolasesOrientador: André Ricardo de Lima DamásioDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A biomassa lignocelulósica é uma fonte de energia facilmente encontrada na natureza e atualmente é aplicada à produção de etanol celulósico. A hidrólise enzimática dessa biomassa corresponde a um passo crucial na obtenção de açúcares fermentáveis e requer enzimas altamente estáveis. Portanto, as enzimas termofílicas são uma alternativa promissora devido à alta estabilidade sob elevadas temperaturas. No entanto, o principal desafio tem sido a produção de enzimas termofílicas em hospedeiros mesofílicos com alto rendimento e baixo custo. Com isso, o objetivo deste projeto foi realizar uma análise da secreção de diferentes enzimas hipertermofílicas após clonagem no vetor pEXPYR+ e, posteriormente, transformação em Aspergillus nidulans A773. Para isso, foram selecionados seis genes alvos: xilanase GH10 (them1; Tpet_0854) arabinanase GH43 (them4; Tpet_0637), arabinofuranosidase GH51 (them5; Tpet_0631), endoglucanase GH12 (tcel1; o-Egla), endoglucanase GH12 (tcel6; ZP#4) e endoglucanase processadora GH5 (tcel4; E1 ). Os genes tcel1, tcel4 e tcel6 foram clonados de Pyrococcus furiosus, Pyrococcus abyssi e Caldivirga maquilingensis, e them1, them4 e them5 foram clonados de Thermotoga petrophila. Inicialmente, a produção das enzimas hipertermofílicas foi analisada por SDS-PAGE em que foi possível identificar apenas a secreção de xilanase GH10 (Them1). Partindo desses resultados, avaliou-se a expressão dos genes alvo por qPCR e os resultados demonstraram que, quatro dos seis genes termofílicos foram bem expressos em A. nidulans. Selecionou-se xilanase GH10 (Them1) e arabinofuranosidase GH51 (Them5) para avaliar a expressão/secreção e produção após o cultivo em diferentes concentrações do indutor (0,01; 0,1; 1; 2; e 5,0% de maltose). Além disso, buscando solucionar o problema de secreção adicionou-se sítios de N-glicosilação na sequência da arabinofuranosidase GH51 (Them5), mimetizando os sítios identificados em uma proteína homóloga de A. nidulans. Por último, realizou-se uma análise comparativa de expressão/secreção e produção de uma xilanase GH10 homóloga (xlnE/AN7401) em relação à xilanase heterólogaAbstract: Lignocellulosic biomass is a source of energy easily found in nature and is currently applied to the production of cellulosic ethanol. The enzymatic hydrolysis of this biomass corresponds to a crucial step in obtaining fermentable sugars and requires highly stable enzymes. Therefore, thermophilic enzymes are a promising alternative because of the high stability at elevated temperatures. However, the main challenge has been the production of thermophilic enzymes in mesophilic hosts with high efficiency and low cost. Therefore, the objective of this project was to perform an analysis of the secretion of different hyperthermophilic enzymes after cloning in pEXPYR+ vector and, later, transformation in Aspergillus nidulans A773. For this, six target genes were selected: xylanase GH10 (them1, Tpet_0854) arabinanase GH43 (them4, Tpet_0637), arabinofuranosidase GH51 (them5, Tpet_0631), endoglucanase GH12 (tcel1; o-Egla), endoglucanase GH12 (tcel6; ZP # 4) and endoglucanase GH5 processor (tcel4; E1). The tcel1, tcel4 and tcel6 genes were cloned from Pyrococcus furiosus, Pyrococcus abyssi and Caldivirga maquilingensis, and the genes them1, them4 and them5 were cloned from Thermotoga petrophila. Initially, the production of the hyperthermophilic enzymes was analyzed by SDS-PAGE in which it was possible to identify only the secretion of the xylanase GH10 (Them1). From these results, the expression of the target genes by qPCR was evaluated and the results demonstrated that four out the six thermophilic genes were well expressed in A. nidulans. The GH10 xylanase (Them1) and arabinofuranosidase GH51 (Them5) were selected to evaluate expression/secretion and production after culturing at different inducer concentrations (0.01, 0.1, 1; 2, and 5.0%). In addition, in order to solve the secretion problem, N-glycosylation sites were added in the arabinofuranosidase sequence GH51 (Them5), mimicking the identified sites in an A. nidulans homologous protein. Finally, a comparative expression/secretion analysis and the production of a homologous GH10 xylanase (xlnE/AN7401) in relation to the heterologous xylanase was performedMestradoFármacos, Medicamentos e Insumos para SaúdeMestra em Biociências e Tecnologia de Produtos BioativosFAEPEX[s.n.]Damásio, André Ricardo de Lima, 1983-Segato, FernandoCosta, Aline Carvalho daUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de BiologiaPrograma de Pós-Graduação em Biociências e Tecnologia de Produtos BioativosUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASGerhardt, Jaqueline Aline, 1990-20182018-07-06T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdf1 recurso online (69 p.) : il., digital, arquivo PDF.https://hdl.handle.net/20.500.12733/1634511GERHARDT, Jaqueline Aline. Expressão heteróloga de enzimas hipertermofílicas em "Aspergillus nidulans". 2018. 1 recurso online (69 p.) Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1634511. Acesso em: 3 set. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/1060061Requisitos do sistema: Software para leitura de arquivo em PDFporreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2021-05-12T10:43:16Zoai::1060061Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2021-05-12T10:43:16Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
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