Expressão heteróloga, análise bioquímica e avaliação da produção fermentativa de uma enzima exo-arabinanase da família GH93

• Autor(a) principal: Mendoza, Josman Andrey Velasco
• Data de Publicação: 2018
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/97/97132/tde-03122018-181621/
• topic: Aspergillus nidulans; Asperguillus nidulans; Exo-?-1,5-arabinanase; Exo-?-1,5-arabinanase; Expressão heteróloga; Fermentação fúngica; Fungal fermentation; Heterologous expression

Segundo a classificação CAZy (Carbohydrate Active enZymes), as glicosil hidrolases (GH) da família 93 são exo-?-1,5-arabinanases que atuam nas ligações ?-1,5 que unem os resíduos de L-arabinofuranosideo que conformam a cadeia principal de arabinana desramificada, liberando arabinose ou arabinobiose. Esta recém descrita família de enzimas, além de ter o potencial de participar junto com outras proteínas na sacarificação de resíduos industriais como a polpa de beterraba, oferece a possibilidade de sintetizar novas moléculas, pois alguns membros desta família podem catalisar reações de transarabinosilação utilizando glicerol, xilitol e sorbitol como aceptores. Embora as GH93 apresentem caraterísticas atrativas para aplicações industriais, até o momento apenas cinco enzimas desta família foram caraterizadas bioquimicamente, sendo que a maioria delas apresentou maior atividade em pHs ácidos e nenhuma com caraterísticas termofílicas. Neste trabalho uma exo-?-1,5-arabinanase abnt do fungo termofílico Thielavia terrestris foi expressa heterólogamente pela primeira vez em fungo filamentoso, utilizando Aspergillus nidulans linhagem A773 transformado com o vetor pEXPYR como sistema de expressão. A enzima foi caraterizada bioquimicamente e sua produção fermentativa avaliada, utilizando dois tipos de indutores em diferentes concentrações e condições de cultivo, escolhendo a melhor condição para o escalonamento. A proteína recombinante de 39,8 KDa mostrou ser uma glicoproteína com uma atividade especifica de 248 U.mg-1 em arabinana desramificada 0,28 mM, pH 5 e temperatura de 70 ?C (valores ótimos para enzima), um Km 0,29 mM, Vmax 0,45 ?mol.min-1, Kcat 115,4 s-1, e eficiência catalítica de 3,9 *105 s-1 M-1, mostrando também um aumento de 34% na liberação de produto quando incubada na presença de CoCl2 1mM. Esta é a primeira exo-arabinanase reportada na literatura com comportamento termofílico e prolongada estabilidade em pHs ácidos. No processo fermentativo a melhor produção de abnt foi atingida usando 3% (m/v) do indutor em condições de cultivo submerso, o escalonamento do processo não afetou a produção enzimática. O sistema de expressão A. nidulans+pEXPYR foi capaz de produzir a mesma quantidade de proteína recombinante utilizando como indutor, um composto cinquenta vezes mais barato que o normalmente utilizado.