Caracterização molecular de domínios funcionais de miosinas de drosophila melanogaster

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Polo, Carla Cristina, 1987-
Data de Publicação: 2012
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1617910
Resumo: Orientador: Mário Tyago Murakami
id UNICAMP-30_db0075129b143a07acd6d00f7ed7bc77
oai_identifier_str oai::863588
network_acronym_str UNICAMP-30
network_name_str Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
repository_id_str
spelling Caracterização molecular de domínios funcionais de miosinas de drosophila melanogasterMolecular characterization of drosophia melanogaster myosins functional domainsDrosophila melanogasterModelos biológicosMiosina tipo VMiosina tipo XVCauda globularDrosophila melanogasterBiological modelsMyosin type VGlobular tailMyosin type XVFERM domainOrientador: Mário Tyago MurakamiDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: As miosinas pertencem a uma família de proteínas motoras que através da hidrólise de ATP são capazes de se movimentarem pelas fibras de actina. Sua estrutura é dividida em três domínios principais: motor, responsável pela hidrólise do ATP; regulador, envolvido na ligação de cadeias leves de calmodulina e a cauda, que tem papel essencial na mediação de interações com cargas celulares, como organelas, ácidos nucleicos e outras proteínas. O organismo modelo para insetos, Drosophila melanogaster, possui 11 miosinas pertencentes a 8 classes sendo que informações funcionais e bioquímicas são escassas, e estruturais, inexistentes. Apesar dos grandes avanços obtidos nos estudos de miosinas humanas, as miosinas de inseto ainda são pouco caracterizadas não havendo estudos comparativos, como por exemplo, para a determinação de conservação de parceiros moleculares entre os diferentes filos da classificação de Lineu. Neste contexto, foram selecionados os seguintes domínios de inseto para caracterização molecular: quinase da miosina III, cauda globular da miosina V e FERM da miosina XV. A partir do cDNA da pupa e adulto do inseto foram amplificados os fragmentos de genes de interesse e clonados em vetor de clonagem, pGEM T-easy, e posteriormente de expressão, pET28a e pET28aSUMO. Após testes em diversas condições no sistema bacteriano, as construções cauda globular da miosina V (GLOB_2 e GT-f) e domínio FERM-f da miosina XV foram obtidos na fração solúvel e com rendimento suficiente para estudos estruturais. O protocolo de expressão em larga escala assim como de purificação foram estabelecidos para cada uma dessas construções. Estudos biofísicos por aSEC, DLS, CD e SAXS foram realizados para a proteína GT-f da miosina V, mostrando a proteína monomérica com alto conteúdo de hélices-alfa corroborando as análises in silico e com as caudas globulares de miosinas ortólogas já descritas. Além disso, sua termoestabilidade foi avaliada com Tm de 46 ºC e que sua estabilidade é alterada pela adição de alguns ligantes, mas não pela força iônica como verificado para a cauda globular da miosina Va humana. A estrutura a baixa resolução da GT-f foi determinada pelos experimentos de SAXS, mostrou uma proteína monomérica com forma alongada (Dmax =100 Å). Para a construção FERM-f, apesar do sucesso alcançado no protocolo de expressão e purificação, a amostra permaneceu polidispersa e com uma estrutura random coil, inviabilizado futuros experimentos. Acredita-se que a ausência do domínio MyTH4, gerou a perda de estabilidade do domínio FERM-f e será necessária a clonagem dos dois domínios fusionados para garantir a estabilidade estrutural e funcionalAbstract: Myosins belong to a motor protein superfamily that uses the ATP hydrolysis to move along actin filaments. Its structural architecture comprises three main domains: motor, responsible for ATP hydrolysis; regulator, which binds calmodulin light chains; and tail, responsible for cellular cargoes binding. Drosophila melanogaster, an insect model, has 11 myosins belonging to 8 different myosin classes; however functional and biochemical data are scanty, and, structural, absent. Although the great advances on investigating human and yeast myosins with the elucidation of molecular partners and molecular mechanisms involved in signaling, there are no comparative studies among different phyla. Therefore, in order to gain insights into insect myosins, in silico analysis were performed and some domains like kinase (myosin III), globular tail (myosin V), and FERM (myosin XV) were selected for biophysical and structural studies. From pupa and adult cDNAs, the target genes were amplified and cloned into pGEM- T-easy, pET28a and pET28aSUMO vectors. After expressions tests, the myosin V globular tail constructs, GLOB_2 and GT-f, and myosin XV FERM-f were obtained in soluble fraction and in sufficient amounts for structural studies. aSEC, DLS, CD e SAXS biophysical studies were performed to myosin V GT-f, showing that the protein is monomeric with predominance of alpha-helix in accordance with the in silico atomic model. The stability of GT-f was assessed with a Tm of 46 ºC and some molecules are able to increase the stability, while the ionic strength has no difference like was observed for the human globular tail of myosin Va. The low resolution structure determined by SAXS experiments confirmed the monomeric state and its elongated molecular shape (Dmax = 100 Å). The FERM-f construct, although the purification and expression protocol were standardized, the sample remained polydisperse with a random coil structure, disabling other biophysical experiments. It is supposed that the absence of the MyTH4 domain in the FERM-f domain results in loss of stability, and cloning and expression of fused domains will be necessary to guarantee structural and functional stabilityMestradoBioquímicaMestre em Biologia Funcional e Molecular[s.n.]Murakami, Mário Tyago, 1981-Leme, Adriana Franco PaesFigueira, Ana Carolina MiglioriniUniversidade Estadual de Campinas. Instituto de BiologiaPrograma de Pós-Graduação em Biologia Funcional e MolecularUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASPolo, Carla Cristina, 1987-20122012-08-04T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdf97 p. : il.https://hdl.handle.net/20.500.12733/1617910POLO, Carla Cristina. Caracterização molecular de domínios funcionais de miosinas de drosophila melanogaster. 2012. 97 p. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1617910. Acesso em: 15 mai. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/863588porreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2017-02-18T06:38:54Zoai::863588Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2017-02-18T06:38:54Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
dc.title.none.fl_str_mv Caracterização molecular de domínios funcionais de miosinas de drosophila melanogaster
Molecular characterization of drosophia melanogaster myosins functional domains
title Caracterização molecular de domínios funcionais de miosinas de drosophila melanogaster
spellingShingle Caracterização molecular de domínios funcionais de miosinas de drosophila melanogaster
Polo, Carla Cristina, 1987-
Drosophila melanogaster
Modelos biológicos
Miosina tipo V
Miosina tipo XV
Cauda globular
Drosophila melanogaster
Biological models
Myosin type V
Globular tail
Myosin type XV
FERM domain
title_short Caracterização molecular de domínios funcionais de miosinas de drosophila melanogaster
title_full Caracterização molecular de domínios funcionais de miosinas de drosophila melanogaster
title_fullStr Caracterização molecular de domínios funcionais de miosinas de drosophila melanogaster
title_full_unstemmed Caracterização molecular de domínios funcionais de miosinas de drosophila melanogaster
title_sort Caracterização molecular de domínios funcionais de miosinas de drosophila melanogaster
author Polo, Carla Cristina, 1987-
author_facet Polo, Carla Cristina, 1987-
author_role author
dc.contributor.none.fl_str_mv Murakami, Mário Tyago, 1981-
Leme, Adriana Franco Paes
Figueira, Ana Carolina Migliorini
Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia
Programa de Pós-Graduação em Biologia Funcional e Molecular
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
dc.contributor.author.fl_str_mv Polo, Carla Cristina, 1987-
dc.subject.por.fl_str_mv Drosophila melanogaster
Modelos biológicos
Miosina tipo V
Miosina tipo XV
Cauda globular
Drosophila melanogaster
Biological models
Myosin type V
Globular tail
Myosin type XV
FERM domain
topic Drosophila melanogaster
Modelos biológicos
Miosina tipo V
Miosina tipo XV
Cauda globular
Drosophila melanogaster
Biological models
Myosin type V
Globular tail
Myosin type XV
FERM domain
description Orientador: Mário Tyago Murakami
publishDate 2012
dc.date.none.fl_str_mv 2012
2012-08-04T00:00:00Z
dc.type.status.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.type.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/masterThesis
format masterThesis
status_str publishedVersion
dc.identifier.uri.fl_str_mv https://hdl.handle.net/20.500.12733/1617910
POLO, Carla Cristina. Caracterização molecular de domínios funcionais de miosinas de drosophila melanogaster. 2012. 97 p. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1617910. Acesso em: 15 mai. 2024.
url https://hdl.handle.net/20.500.12733/1617910
identifier_str_mv POLO, Carla Cristina. Caracterização molecular de domínios funcionais de miosinas de drosophila melanogaster. 2012. 97 p. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1617910. Acesso em: 15 mai. 2024.
dc.language.iso.fl_str_mv por
language por
dc.relation.none.fl_str_mv https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/863588
dc.rights.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/openAccess
eu_rights_str_mv openAccess
dc.format.none.fl_str_mv application/pdf
97 p. : il.
dc.publisher.none.fl_str_mv [s.n.]
publisher.none.fl_str_mv [s.n.]
dc.source.none.fl_str_mv reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
instacron:UNICAMP
instname_str Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
instacron_str UNICAMP
institution UNICAMP
reponame_str Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
collection Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
repository.name.fl_str_mv Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
repository.mail.fl_str_mv sbubd@unicamp.br
_version_ 1799138497694531584

Registros relacionados