Caracterização molecular de domínios funcionais de miosinas de drosophila melanogaster
Autor(a) principal: | |
---|---|
Data de Publicação: | 2012 |
Tipo de documento: | Dissertação |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) |
Texto Completo: | https://hdl.handle.net/20.500.12733/1617910 |
Resumo: | Orientador: Mário Tyago Murakami |
id |
UNICAMP-30_db0075129b143a07acd6d00f7ed7bc77 |
---|---|
oai_identifier_str |
oai::863588 |
network_acronym_str |
UNICAMP-30 |
network_name_str |
Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) |
repository_id_str |
|
spelling |
Caracterização molecular de domínios funcionais de miosinas de drosophila melanogasterMolecular characterization of drosophia melanogaster myosins functional domainsDrosophila melanogasterModelos biológicosMiosina tipo VMiosina tipo XVCauda globularDrosophila melanogasterBiological modelsMyosin type VGlobular tailMyosin type XVFERM domainOrientador: Mário Tyago MurakamiDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: As miosinas pertencem a uma família de proteínas motoras que através da hidrólise de ATP são capazes de se movimentarem pelas fibras de actina. Sua estrutura é dividida em três domínios principais: motor, responsável pela hidrólise do ATP; regulador, envolvido na ligação de cadeias leves de calmodulina e a cauda, que tem papel essencial na mediação de interações com cargas celulares, como organelas, ácidos nucleicos e outras proteínas. O organismo modelo para insetos, Drosophila melanogaster, possui 11 miosinas pertencentes a 8 classes sendo que informações funcionais e bioquímicas são escassas, e estruturais, inexistentes. Apesar dos grandes avanços obtidos nos estudos de miosinas humanas, as miosinas de inseto ainda são pouco caracterizadas não havendo estudos comparativos, como por exemplo, para a determinação de conservação de parceiros moleculares entre os diferentes filos da classificação de Lineu. Neste contexto, foram selecionados os seguintes domínios de inseto para caracterização molecular: quinase da miosina III, cauda globular da miosina V e FERM da miosina XV. A partir do cDNA da pupa e adulto do inseto foram amplificados os fragmentos de genes de interesse e clonados em vetor de clonagem, pGEM T-easy, e posteriormente de expressão, pET28a e pET28aSUMO. Após testes em diversas condições no sistema bacteriano, as construções cauda globular da miosina V (GLOB_2 e GT-f) e domínio FERM-f da miosina XV foram obtidos na fração solúvel e com rendimento suficiente para estudos estruturais. O protocolo de expressão em larga escala assim como de purificação foram estabelecidos para cada uma dessas construções. Estudos biofísicos por aSEC, DLS, CD e SAXS foram realizados para a proteína GT-f da miosina V, mostrando a proteína monomérica com alto conteúdo de hélices-alfa corroborando as análises in silico e com as caudas globulares de miosinas ortólogas já descritas. Além disso, sua termoestabilidade foi avaliada com Tm de 46 ºC e que sua estabilidade é alterada pela adição de alguns ligantes, mas não pela força iônica como verificado para a cauda globular da miosina Va humana. A estrutura a baixa resolução da GT-f foi determinada pelos experimentos de SAXS, mostrou uma proteína monomérica com forma alongada (Dmax =100 Å). Para a construção FERM-f, apesar do sucesso alcançado no protocolo de expressão e purificação, a amostra permaneceu polidispersa e com uma estrutura random coil, inviabilizado futuros experimentos. Acredita-se que a ausência do domínio MyTH4, gerou a perda de estabilidade do domínio FERM-f e será necessária a clonagem dos dois domínios fusionados para garantir a estabilidade estrutural e funcionalAbstract: Myosins belong to a motor protein superfamily that uses the ATP hydrolysis to move along actin filaments. Its structural architecture comprises three main domains: motor, responsible for ATP hydrolysis; regulator, which binds calmodulin light chains; and tail, responsible for cellular cargoes binding. Drosophila melanogaster, an insect model, has 11 myosins belonging to 8 different myosin classes; however functional and biochemical data are scanty, and, structural, absent. Although the great advances on investigating human and yeast myosins with the elucidation of molecular partners and molecular mechanisms involved in signaling, there are no comparative studies among different phyla. Therefore, in order to gain insights into insect myosins, in silico analysis were performed and some domains like kinase (myosin III), globular tail (myosin V), and FERM (myosin XV) were selected for biophysical and structural studies. From pupa and adult cDNAs, the target genes were amplified and cloned into pGEM- T-easy, pET28a and pET28aSUMO vectors. After expressions tests, the myosin V globular tail constructs, GLOB_2 and GT-f, and myosin XV FERM-f were obtained in soluble fraction and in sufficient amounts for structural studies. aSEC, DLS, CD e SAXS biophysical studies were performed to myosin V GT-f, showing that the protein is monomeric with predominance of alpha-helix in accordance with the in silico atomic model. The stability of GT-f was assessed with a Tm of 46 ºC and some molecules are able to increase the stability, while the ionic strength has no difference like was observed for the human globular tail of myosin Va. The low resolution structure determined by SAXS experiments confirmed the monomeric state and its elongated molecular shape (Dmax = 100 Å). The FERM-f construct, although the purification and expression protocol were standardized, the sample remained polydisperse with a random coil structure, disabling other biophysical experiments. It is supposed that the absence of the MyTH4 domain in the FERM-f domain results in loss of stability, and cloning and expression of fused domains will be necessary to guarantee structural and functional stabilityMestradoBioquímicaMestre em Biologia Funcional e Molecular[s.n.]Murakami, Mário Tyago, 1981-Leme, Adriana Franco PaesFigueira, Ana Carolina MiglioriniUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de BiologiaPrograma de Pós-Graduação em Biologia Funcional e MolecularUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASPolo, Carla Cristina, 1987-20122012-08-04T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdf97 p. : il.https://hdl.handle.net/20.500.12733/1617910POLO, Carla Cristina. Caracterização molecular de domínios funcionais de miosinas de drosophila melanogaster. 2012. 97 p. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1617910. Acesso em: 3 set. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/863588porreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2017-02-18T06:38:54Zoai::863588Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2017-02-18T06:38:54Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false |
dc.title.none.fl_str_mv |
Caracterização molecular de domínios funcionais de miosinas de drosophila melanogaster Molecular characterization of drosophia melanogaster myosins functional domains |
title |
Caracterização molecular de domínios funcionais de miosinas de drosophila melanogaster |
spellingShingle |
Caracterização molecular de domínios funcionais de miosinas de drosophila melanogaster Polo, Carla Cristina, 1987- Drosophila melanogaster Modelos biológicos Miosina tipo V Miosina tipo XV Cauda globular Drosophila melanogaster Biological models Myosin type V Globular tail Myosin type XV FERM domain |
title_short |
Caracterização molecular de domínios funcionais de miosinas de drosophila melanogaster |
title_full |
Caracterização molecular de domínios funcionais de miosinas de drosophila melanogaster |
title_fullStr |
Caracterização molecular de domínios funcionais de miosinas de drosophila melanogaster |
title_full_unstemmed |
Caracterização molecular de domínios funcionais de miosinas de drosophila melanogaster |
title_sort |
Caracterização molecular de domínios funcionais de miosinas de drosophila melanogaster |
author |
Polo, Carla Cristina, 1987- |
author_facet |
Polo, Carla Cristina, 1987- |
author_role |
author |
dc.contributor.none.fl_str_mv |
Murakami, Mário Tyago, 1981- Leme, Adriana Franco Paes Figueira, Ana Carolina Migliorini Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia Programa de Pós-Graduação em Biologia Funcional e Molecular UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS |
dc.contributor.author.fl_str_mv |
Polo, Carla Cristina, 1987- |
dc.subject.por.fl_str_mv |
Drosophila melanogaster Modelos biológicos Miosina tipo V Miosina tipo XV Cauda globular Drosophila melanogaster Biological models Myosin type V Globular tail Myosin type XV FERM domain |
topic |
Drosophila melanogaster Modelos biológicos Miosina tipo V Miosina tipo XV Cauda globular Drosophila melanogaster Biological models Myosin type V Globular tail Myosin type XV FERM domain |
description |
Orientador: Mário Tyago Murakami |
publishDate |
2012 |
dc.date.none.fl_str_mv |
2012 2012-08-04T00:00:00Z |
dc.type.status.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
dc.type.driver.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/masterThesis |
format |
masterThesis |
status_str |
publishedVersion |
dc.identifier.uri.fl_str_mv |
https://hdl.handle.net/20.500.12733/1617910 POLO, Carla Cristina. Caracterização molecular de domínios funcionais de miosinas de drosophila melanogaster. 2012. 97 p. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1617910. Acesso em: 3 set. 2024. |
url |
https://hdl.handle.net/20.500.12733/1617910 |
identifier_str_mv |
POLO, Carla Cristina. Caracterização molecular de domínios funcionais de miosinas de drosophila melanogaster. 2012. 97 p. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1617910. Acesso em: 3 set. 2024. |
dc.language.iso.fl_str_mv |
por |
language |
por |
dc.relation.none.fl_str_mv |
https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/863588 |
dc.rights.driver.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/openAccess |
eu_rights_str_mv |
openAccess |
dc.format.none.fl_str_mv |
application/pdf 97 p. : il. |
dc.publisher.none.fl_str_mv |
[s.n.] |
publisher.none.fl_str_mv |
[s.n.] |
dc.source.none.fl_str_mv |
reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) instacron:UNICAMP |
instname_str |
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) |
instacron_str |
UNICAMP |
institution |
UNICAMP |
reponame_str |
Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) |
collection |
Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) |
repository.name.fl_str_mv |
Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) |
repository.mail.fl_str_mv |
sbubd@unicamp.br |
_version_ |
1809189078537601024 |