Expressão e purificação heteróloga do fator de transcrição induzido por hipóxia HIF-1 humano visando estudos estruturais e bioquímicos e estudos estruturais das prolil-hidroxilases (PHDs) humanas, isoformas 1 e 3, em complexo com inibidores

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Fala, Angela Maria, 1983-
Data de Publicação: 2013
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1621386
Resumo: Orientador: Andre Luís Berteli Ambrósio
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spelling Expressão e purificação heteróloga do fator de transcrição induzido por hipóxia HIF-1 humano visando estudos estruturais e bioquímicos e estudos estruturais das prolil-hidroxilases (PHDs) humanas, isoformas 1 e 3, em complexo com inibidoresHeterologous expression and purification of the hypoxia-induced factor HIF-1 human aiming structural and biochemical studies and structural studies of prolyl-hydroxylases (PHDs) human, isoforms 1 and 3, in complex with inhibitorsFator 1 induzível por hipóxiaProlil hidroxilasesFluorescência anisotrópicaHypoxia-inducible factor 1Prolyl hydroxylase domainFluorescence polarizationOrientador: Andre Luís Berteli AmbrósioDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências MédicasResumo: A adaptação das células cancerosas ao microambiente é o ponto central que leva ao fenótipo invasivo e metastático, e é garantida principalmente através do controle preciso da expressão gênica. A resposta às necessidades energéticas e biossintéticas e principalmente à disponibilidade de oxigênio intracelular, por exemplo, é em grande parte mediada pelo fator de transcrição induzido por hipóxia 1 (HIF-1). HIF-1 é um heterodímero composto pelas subunidades ? e ?, que respondem a sequência consenso (5'-RCGTG-3') e ativam a transcrição de mais de 100 genes envolvidos em diversos aspectos cruciais da biologia tumoral, incluindo angiogênese, metabolismo de glicose, diferenciação celular, apoptose e resistência a radio e quimioterapias. São conhecidas três isoformas da subunidade ? (1 a 3) e todas se heterodimerizam com a subunidade ?. No geral, HIFs são constituídas de diferentes domínios funcionais, como de ligação ao DNA, de heterodimerização, transativação e degradação. Atualmente, pouco se sabe sobre os mecanismos estruturais e funcionais dos domínios da HIF- 1, deste modo este trabalho objetivou o estudo estrutural destes domínios. Os domínios bHLH, Pas-1 e Pac de HIF-1? e HIF-? em diferentes combinações entre si e o domínio Pac da HIF-3? foram clonados, as proteínas foram expressas em sistema bacteriano e purificadas por diferentes técnicas cromatográficas. Diversas destas construções se mostraram insolúveis ou suscetíveis a degradação, enquanto outras foram purificadas com sucesso. As construções Pac, um exemplo de sucesso na produção, foram submetidas a ensaios de anisotropia de fluorescência e ressonância magnética nuclear, o que nos permitiu a caracterização dos perfis de interação entre as várias combinações de heterodimerização. Neste contexto, os resultados mostram que o equilíbrio dinâmico da interação entre Pac-1? com a subunidade -1? é alcançado imediatamente, enquanto que para a interação entre Pac-3? e -1?, são necessários pelo menos 30 horas de incubação. O mesmo pode ser extraído da caracterização da interação direta entre Pac-1? e Pac-3?. Nos experimentos de RMN, foi possível identificar a região de interação entre as subunidades -1? e -3? com a subunidade ?, separadamente. Ambas as subunidades ? interagem com a Pac-1? na região das fitas-beta 1 e 5 e no loop entre as fitas 4 e 5. Em conjunto, estes resultados impactam no mecanismo de antagonização de HIF-3? na atividade transcricional de HIF-1?. Houve ainda a formação de monocristais da subunidade Pac-3?, que foram submetidos a experimentos preliminares de difração de raios X, que apesar de resultar em dados anisotrópicos e insuficientes para resolução estrutural, permitiram a caracterização dos parâmetros cristalinos, incluindo a presença de um alto conteúdo de solvente. Adicionalmente, são também apresentados os resultados obtidos visando a expressão e cristalização das Prolilhidroxilases (PHDs) isoformas 1 a 4, durante estágio de seis meses no Structural Genomics Consortium (SGC), da Universidade de Oxford, na Inglaterra. Foram expressas de maneira solúvel e purificadas, diversas construções das isoformas 1 e 3 das PHDs humanas. Cristais foram obtidos, porém estes foram determinados como sendo de compostos inorgânicos presentes na condição de cristalização. Como resultado final, está sendo estabelecida uma colaboração entre o nosso grupo e o SGC para que os estudos estruturais com PHDs se estendam e sejam realizados em nosso laboratório aqui no BrasilAbstract: The adaptation process of cancer cells to the microenvironment is the central point leading to the invasive and metastatic phenotypes, and is guaranteed mainly through the precise control of gene expression. The cell response to the energetic and biosynthetic needs and especially to the availability of intracellular oxygen is mediated by the hypoxia inducible transcription factor 1, or HIF-1. HIF-1 functions as a heterodimer composed by subunits ? and ?, binding to responsive elements with the consensus sequence 5'-RCGTG-3 ', thus activating the transcription of more than 100 genes involved in many crucial aspects of tumor biology, including angiogenesis, metabolism glucose, cell differentiation, apoptosis, and resistance to radiotherapy and chemotherapy. There are three known isoforms of the ? subunit (1, 2 and 3) and all heterodimerize with the ? subunit. HIFs are composed of different functional domains, such as the DNA binding domain, the heterodimerization, transactivation and the oxygen-dependent degradation domains. Currently, little is known about the mechanisms of structural and functional domains of HIF-1, thus this work was to study these structural domains. The domain (bHLH, Pas-1 and Pac) of HIF-1? and HIF-? in different combinations with each other and Pac domain of HIF-3? were cloned, the proteins were expressed in bacterial system and purified by various chromatographic techniques. Several of these constructs proved insoluble or susceptible to degradation, while others were purified successfully. The constructs Pac, an example of success in production, were tested for fluorescence anisotropy and nuclear magnetic resonance, which allowed us to characterize the profiles of the interaction between the various combinations of heterodimers. In this context, the results show that the dynamic equilibrium of the interaction between the Pac-1? and -1? subunits is achieved immediately, whereas for the interaction between Pac-3? and -1?, it takes at least 30 hours of incubation. The same can be observed from the characterization of direct interaction between Pac-1? and -3?. From the NMR experiments, it was possible to identify the region of interaction between the subunits -1? and -3? with the -1? subunit. Both ? subunits interact with Pac-1? via betastrands 1 and 5 and the loop between the strands 4 and 5. Overall, these results impact in the mechanism of HIF-3? antagonizing the transcriptional activity of HIF-1?. We also obtained single crystals for Pac-3? subunit, which were subjected to preliminary experiments of X-ray diffraction. Although resulting in anisotropic, insufficient data for and structural resolution, it has allowed the characterization of crystalline parameters, including the presence of a high solvent content. Additionally, we also present the results targeting the expression and crystallization of Prolyl-hydroxylases (PHDs) human isoforms 1-4, during the six-month period at the Structural Genomics Consortium (SGC), the University of Oxford in England. Several construct from of isoforms 1 and 3 were successfully expressed and purified in the soluble form. Likewise, crystals were obtained, but these were determined to be composed by inorganic compounds present in the crystallization conditions. At the end, a collaboration was established between our and the SGC group for the structural studies with the PHDs to extend and carry out the experiments in our lab here in BrazilMestradoClínica MédicaMestra em Clínica Médica[s.n.]Ambrosio, Andre Luís Berteli, 1978-Cordeiro, Artur TorresPereira, Humberto D'MunizUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Ciências MédicasPrograma de Pós-Graduação em Clínica MédicaUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASFala, Angela Maria, 1983-2013info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdf142 p. : il.https://hdl.handle.net/20.500.12733/1621386FALA, Angela Maria. Expressão e purificação heteróloga do fator de transcrição induzido por hipóxia HIF-1 humano visando estudos estruturais e bioquímicos e estudos estruturais das prolil-hidroxilases (PHDs) humanas, isoformas 1 e 3, em complexo com inibidores. 2013. 142 p. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1621386. Acesso em: 3 set. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/915189porreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2017-02-18T07:08:47Zoai::915189Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2017-02-18T07:08:47Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
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