Expressão heteróloga, purificação e análise da imunoreatividade do alérgeno antígeno 5 do veneno de Polybia paulista (Hymenoptera, Vespidae)

• Autor(a) principal: Bazon, Murilo Luiz [UNESP]
• Data de Publicação: 2017
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNESP
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/11449/149775
• topic: Alérgeno recombinante; Polybia paulista; Expressão heteróloga; Vespa; Pichia pastoris

A vespa social Polybia paulista é muito agressiva e abundante nos Estados de São Paulo e Sul de Minas Gerais e, responsável por muitos acidentes de importância médica. Os principais alérgenos (Fosfolipase, Hialuronidase e Antígeno 5) de seu veneno já foram caracterizados por estudos proteômicos porém, os estudos em nível molecular estão em andamento pelo nosso grupo. O Antígeno 5 (Ag 5) (~23 kDa) tem sido relatado, em alguns venenos de vespas, como um dos mais abundantes e importantes alérgenos, com elevada prevalência de ligação a IgE (em Vespula vulgaris e em Polistes versicolor) enquanto que em outros, como uma molécula hipoalergênica (em Polybia scutellaris). No Brasil, ainda não existem extratos alergênicos ou componentes padronizados para o tratamento e diagnóstico de alergia ao veneno de Hymenoptera. Neste trabalho, o Ag 5 de P. paulista foi clonado, sequenciado, expresso utilizando a levedura Pichia pastoris X-33, purificado e analisado mediante a imunodetecção por IgE. Os maiores níveis de expressão da proteína recombinante rPoly p 5 foram obtidos em meio BMMY, a 28ºC após 120 horas de indução com metanol. O alérgeno recombinante (rPoly p 5), obtido no meio extracelular, foi purificado por cromatografia de afinidade em resina de Ni+2 e posteriormente por exclusão molecular em coluna de Sephadex-G 100 acoplada a um sistema AKTA-FPLC, com um rendimento de 158 μg/mL. Em paralelo, o Ag 5 nativo (nPoly p 5) foi extraído de glândulas de veneno de P. paulista e purificado através de cromatografia de troca catiônica. Análise de Western Blotting foi realizada para avaliar a reatividade IgE dos soros de 10 pacientes alérgicos ao veneno de P. paulista para rPoly p 5 e nPoly p 5. Os resultados obtidos mostraram que P. pastoris é um sistema muito viável para a produção heteróloga do alérgeno rPoly p 5 e que ambas as formas desse alérgeno foram capazes de se ligar à IgE de todos os soros de pacientes alérgicos testados. Portanto, os dados aqui encontrados podem ser utilizados para melhoria no diagnóstico e imunoterapia específica de alergia ao veneno de Polybia paulista.