Caracterização de Estafilococos Coagulase-Negativa de origem hospitalar e comunitária quanto à diversidade clonal e a determinantes de resistência antimicrobiana

• Autor(a) principal: Pinheiro, Luiza
• Data de Publicação: 2018
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNESP
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/11449/154920
• topic: Oxacilina; teste de disco-difusão; cefoxitina; Etest; gene mecA; vancomicina; espessamento de parede celular; alterações morfo-bioquímicas; PFGE; SCCmec; MLST; Oxacillin; disc-diffusion test; cefoxitin; mecA gene; vancomycin; cellwall thickening; morpho-biochemical alterations

A alta frequência de Estafilococos Coagulase-Negativa (CoNS) na pele de indivíduos saudáveis e em doenças associadas ao sangue, associados à seleção de cepas resistentes devido a uso indiscriminado de antimicrobianos, tornou mais estreitos os limites entre o ambiente hospitalar e o comunitário quanto à distribuição de cepas. Objetivou-se, com este estudo, caracterizar isolados de CoNS de origem hospitalar e comunitária da cidade de Botucatu-SP quanto ao perfil clonal, analisar os aspectos de resistência à oxacilina pela aferição de metodologia de detecção, e investigar os determinantes de heterorresistência à vancomicina nessas cepas. As espécies estudadas incluíram S. epidermidis, S. haemolyticus, S. warneri, S. hominis, S. lugdunensis, S. capitis, S. saprophyticus, S. pasteuri, S. simulans e S. xylosus. O teste de disco-difusão (TDD) com discos de oxacilina e cefoxitina, fitas de Etest impregnadas com oxacilina e pesquisa do gene mecA por PCR em tempo real foram realizadas. A triagem em ágar com 6 e 8 µg/ml de vancomicina, microdiluição em caldo para aferição da Concentração Inibirtória Mínima (MIC), microscopia eletrônica de transmissão para verificar espessamento da parede celular e alterações fenotípicas por testes bioquímicos foram realizadas. O perfil clonal foi determinado por PFGE (Pulsed-Field Gel Eletrophoresis) e para clones de S. epidermidis, o MLST (Multilocus Sequence Typing). S. epidermidis apresentou alta diversidade clonal, mas presença de clusters no ambiente hospitalar e na comunidade. Clones hospitalares pertenciam aos STs (sequence-types) 2, 6 e 23. S. haemolyticus revelou pequenos clones circulando separadamente nos ambientes, enquanto S. saprophyticus mostrou altíssima diversidade clonal. Clusters grandes circulando no hospital e comunidade foram encontrados em isolados de S. lugdunensis, S. warneri e S. capitis, demonstrando que provavelmente, nestas espécies, há baixa taxa de eventos de diversidade ou certos clones podem estar se sobressaindo em detrimento de outros. A variedade dos tipos de SCCmec foi bem elevada, sendo que isolados do mesmo cluster possuiam tipos distintos. S. epidermidis teve alta prevalência dos tipos I e III, S. haemolyticus dos tipos I e II, S. capitis do tipo V, S. hominis esteve associado ao complexo mec do tipo A e ccr1, S. warneri e S. saprophyticus ao SCCmec tipo I. A geração de elementos e combinações novas dos genes do cassete se mostrou altamente relacionada às cepas de CoNS, sugerindo que o SCCmec não é um bom marcador para clonalidade nessas bactérias. A concordância entre as técnicas da susceptibilidade à oxacilina foi observada em 65,7% dos casos; bem como, dos isolados resistentes pelo Etest, 93,8% possuíam o gene mecA. A maior discrepância entre mecA/Etest sensível foi em espécies não-epidermidis. Utilizando-se um ponto de corte de ≤19 mm no disco de oxacilina para resistência classificou-se melhor o total de CoNS. Para S. epidermidis separadamente, halos ≤ 19 e 27 mm, respectivamente, classificaram melhor nos discos de oxacilina e cefoxitina. Para S. haemolyticus e S. capitis, respectivamente, diâmetros ≤21 mm e ≤18 mm no disco de oxacilina, e MICs ≥ 0,75 µg/ml para S. warneri para resistência se adequaram melhor à avaliação de resistência à oxacilina nessas espécies. S. saprophyticus mostrou resultados altamente discrepantes, necessitando de uma revisão profunda nos valores de referência. Apesar de o disco de oxacilina não ser mais recomendado pelo CLSI para TDD, observamos alguns casos em que apenas este disco detectou resistência. A discrepância dos testes fenotípicos quando comparada à positividade do gene mecA foi provavelmente devida à característica heterogênea dessa resistência, e ao mecanismo de resistência borderline. De 291 isolados, 12,4% apresentaram crescimento nas placas com 6 ou 8 µg/ml de vancomicina: 8,3% de swab nasal e 19% de hemoculturas. Os MICs de vancomicina estiveram em valores maiores ou iguais a 4 µg/ml em 10 isolados parentais e em 22 colônias heterorresistentes. Colônias crescidas na triagem de isolados selecionados de S. warneri, S. haemolyticus e S. capitis mostraram espessamento de parede celular significativo quando comparado à cepa parental e diâmetro reduzido nos isolados heterorresistentes de S. haemolyticus e S. warneri. Observou-se que 60% das subpopulações apresentaram alteração macroscópica no aspecto das colônias, incluindo diferença de tamanho (27%), e a variação dentro do mesmo isolado (38%). A alteração na fermentação dos açúcares e ornitina foi encontrada, mas não seguiu um padrão. A presença de colônias mistas com características distintas demonstra a necessidade de testar todas quanto à susceptibilidade e identificação fenotípica. Os resultados enfatizam que a subpopulação heterorresistente necessita estar em um número suficiente de células para se expressar nos testes de susceptibilidade e possui natureza instável. O mecanismo de espessamento da parede celular parece ser a causa mais provável de heterorresistência em S. capitis, S. warneri e S. haemolyticus.