Análise da expressão e caracterização funcional in silico de lncRNAs em células epiteliais tímicas medulares nocauteadas no gene Aire

• Autor(a) principal: Mascarenhas, Romário de Sousa
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17135/tde-27052020-081507/
• topic: Autoimmune regulator gene (Aire); Células epiteliais tímicas medulares (mTECs); Gene autoimmune regulator (Aire); Long non-coding RNAs (lncRNAs); Medullary thymic epithelial cells (mTECs); RNA Sequencing (RNA-Seq); RNAs longos não-codificantes (lncRNAs); Sequenciamento de RNA (RNA-Seq)

A tolerância imunológica central refere-se à não responsividade aos auto-antígenos e esse mecanismo envolve a maturação e a seleção de linfócitos T no timo. Durante esse processo, os timócitos autorreativos contra antígenos restritos aos tecidos (TRAs) são eliminados por apoptose (seleção negativa) antes de chegar à periferia. Na homeostase, esse processo evita o desenvolvimento da autoimunidade agressiva. O principal gene envolvido no controle da expressão dos TRAs é o Autoimmune regulator (Aire), responsável pela modulação de cerca de 40% de todos os TRAs expressos em células epiteliais tímicas medulares (mTECs), pois sua proteína correspondente libera a RNA Pol II na etapa de elongação da transcrição. O Aire é considerado um gene pleiotrópico porque está associado a outras funções além da transcrição dos TRAs. Estudos demonstraram que Aire também atua no controle da expressão de RNAs não codificantes (por exemplo, microRNAs) em mTECs. Nossa hipótese é que o Aire também regula a expressão de RNAs longos não codificantes (lncRNAs) nessas células, já que são transcritos pela RNA Pol II. Este estudo teve como objetivo identificar e caracterizar lncRNAs diferencialmente expressos em células mTEC comparando células nocauteadas no gene Aire com células do tipo selvagem (WT) por meio de algoritmos de predição in silico. Utilizamos uma linhagem celular nocauteada no gene Aire (mTEC 3.10E6 Aire KO) obtida anteriormente em nosso laboratório por meio do sistema CRISPR-Cas9. O RNA total da células mTECs Aire KO e mTECs WT foi extraído e depois sequenciado através de RNA-seq (tecnologia Ilumina HiSeq 2500). A análise bioinformática dos dados de RNA-Seq análise de qualidade (FASTQC), trimagem por meio do Trimomatic, montagem de genoma (Mus musculus) (STAR) e análise estatística no ambiente da plataforma R mostrou a expressão diferencial de lncRNAs que foram então caracterizados funcionalmente. Na ausência de Aire foram identificados 136 lncRNAs diferencialmente expressos (DE), sendo 72 hiperregulados e 64 hiporregulados. Após o ensaio de adesão com timócitos houve redução no número de lncRNAs diferencialmente expressos pelas mTECs Aire KO, foram encontrados somente 33 lncRNAs DE, 26 hiperregulados e 7 hiporregulados. Entre eles, destacamos os lncRNAs Ifi30, Morrbid, Malat1, Xist, Gas5 e Neat1, cujas respectivas funções estão relacionadas ao sistema imunológico. Estes resultados mostram que as células mTEC expressam lncRNAs e que o gene Aire está implicado em sua regulação.