Transfecção celular de anti-miR-21 aplicada em linhagem de carcinoma renal de células claras metastáticas

• Autor(a) principal: Nunes, Vitoria Ghazarian
• Data de Publicação: 2023
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5153/tde-16042024-122202/
• topic: Carcinoma Renal de Células Claras; Clear Cell Renal Carcinoma; Metástase; Metastasis; MicroRNA; MicroRNA (miRNAs); MMP9; MMP9; RECK; RECK; Transfecção; Transfection

INTRODUÇÃO: O Carcinoma de Células Renais, é uma neoplasia maligna que se origina no revestimento do túbulo contorcido proximal e durante décadas, pacientes com câncer renal, em sua maioria, submetem-se à nefrectomia radical ou parcial, devido as poucas opções de tratamento. O miR-21, é um microRNA que já foi associado ao crescimento celular e a inibição da apoptose em alguns tipos de câncer e em relação ao carcinoma de células renais, já foi demonstrada uma superexpressão deste miRNA sendo ainda mais relevante no tipo células claras, onde também já foi associado a um pior prognóstico. O miR-21 possui diversos genes alvos, como RECK e MMP9 que podem atuar em processos carcinogênicos. Com o aumento da exploração de estudos acerca da importância dos miRNAs, novas modalidades terapêuticas são desenvolvidas e, dentre elas, surgem os anti- miRs, que são ácidos nucleicos de cadeia simples modificados e sintetizados para se ligarem especificamente ao miRNA de interesse e inibir essas moléculas, levando ao objetivo da perda de expressão. OBJETIVOS: Baseado no potencial oncogênico do miR-21 realizamos a padronização da transfecção de anti-miR-21 em linhagem celular de carcinoma renal de células claras metastáticas (Caki-1), bem como a análise de expressão do miR-21 e de seus genes alvo (RECK e MMP9) pós transfecção. Por fim, realizamos ensaio de migração e imunofluorescência após a transfecção de anti-miR-21. METODOLOGIA: Inicialmente, cultivamos a linhagem Caki-1 em meio de cultura McCoy\'s 5a Medium Modified, suplementado com soro fetal bovino a 10% e solução antibiótica e antimicótica, após o cultivo realizamos a transfecção da linhagem com anti-miR-21 e realizamos a análise de expressão do miR e de seus genes alvo por meio da técnica de qPCR. Também realizamos ensaio de migração e imunoflorescência. Por fim, realizamos análise estatística considerando estatisticamente significantes os resultados com p-valor inferior a 5%. RESULTADOS:. Observamos uma diminuição estatisticamente significante da expressão do miR-21 demonstrando a eficácia da transfecção, além da diminuição da migração celular. Em relação ao gene alvo RECK, demonstramos um aumento significativo da expressão após a transfecção conforme esperado, entretanto o seu gene alvo MMP9 estava superexpresso após a transfecção, embora sem significância estatística. No ensaio de imunoflorescência evidenciamos aumento de expressão de RECK e diminuição de MMP9. DISCUSSÃO: Observamos que com a técnica de tranfecção de anti-miR-21, foi possível, efetuar a diminuição significativa da expressão do miR-21, assim como o aumento de expressão gênica e proteica de RECK, bem como diminuição proteica de MMP9, além da importante diminuição do potencial de migração da linhagem. Dessa forma, consideramos nossos resultados in vitro promissores, pois o miR-21 pode apresentar um papel importante para a progressão do câncer de rim metastático. Nosso trabalho demonstra que essa ferramenta de transfecção pode contribuir com o knockdown do miR-21 no CRCC e retardar sua migração celular. CONCLUSÃO: Concluímos que a metodologia utilizada para padronização da transfecção de anti-miR-21 foi efetiva, no qual as células apresentaram diminuição significante de miR-21 em relação ao controle, assim como um aumento de expressão do seu alvo RECK, porém não apresentou diferença entre MMP9 e controle. Identificamos uma diminuição no potencial de migração da linhagem estudada