Efeito das proteínas NSP4 e ORF9b de SARS-CoV-2 sobre a viabilidade celular e identificação de ligantes contra NSP4

• Autor(a) principal: Yonamine, Deborah Kimie
• Data de Publicação: 2023
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-30012024-145043/
• topic: COVID-19; COVID-19; Ligand fishing; Ligand fishing; Mitochondria; Mitocôndria; NSP4; NSP4; ORF9b; ORF9b; SARS-CoV-2; SARS-CoV-2

A pandemia da doença coronavírus 2019 (COVID-19) causado pelo novo coronavírus humano, denominado de coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2), originou-se em Wuhan, China, tem representado uma ameaça global à saúde humana, à segurança pública e à economia global. Para a produção de vírions maduros de SARS-CoV-2 durante o ciclo infeccioso, os metabólitos das células hospedeiras são requeridos, assim como o escape da resposta antiviral é necessário. Nesse contexto, a replicação do SARS-CoV-2 depende da formação de vesículas de membrana dupla (DMVs) que tem a sua biogênese facilitada pelas proteínas não estruturais NSP3, 4 e 6 e formadas a partir do retículo endoplasmático. Além disso de modo a se evadir da resposta imune do hospedeiro esse vírus possui estratégias para antagonizar as respostas dos interferons, que é suprimido em grande parte pela proteína ORF9b. Considerando a importância da formação dos DMVs, buscou-se identificar compostos contra NSP4 e potencialmente impedir a formação das vesículas de membrana dupla. Nesse sentido, a proteína NSP4 foi expressa em Rosetta(TM)(DE3)pLysS, purificada por cromatografia de afinidade e imobilizada em partículas magnéticas as quais foram submetidas à técnica de Ligand fishing com 10 potenciais alcalóides extraídos de espécies de Amaryllidacea, bem como o seu extrato bruto, dos quais cinco foram identificados como potenciais compostos contra SARS-CoV-2. São eles: 2-α-7-dimetoxihomolicorina, hemantidina, albomaculina, tazetina e aulicina, os quais apresentaram razão de afinidade de 1,89; 3,15; 2,9, 2,42 e 1,45 respectivamente. Além disso, a fim de se entender o papel das proteínas NSP4 e ORF9b diretamente nas células, avaliou-se os seus efeitos quando expressas em células da linhagem de fibroblastos pulmonares neonatais de camundongos MLG2908. Os resultados relevaram que ambas as proteínas aumentaram os níveis de espécies reativas de oxigênio mitocondrial na ordem de 39% e 23%, respectivamente. Além disso, após 24 e 48 h pós-transfecção com Nsp4, houve uma redução significativa nos níveis de MAVS, atingindo 0,11% e 0,29%, respectivamente. De maneira semelhante, ORF9b também reduziu a expressão MAVS em 0,31±0,02 após 24 h de transfecção. Adicionalmente, a NSP4 resultou em uma diminuição de 9% e 11%, nos níveis de viabilidade celular e de ATP, assim como uma redução em 8% e 11% do potencial de membrana após 24 e 48 horas de transfecção, respectivamente. Observou-se também a ativação da via intrínseca da apoptose pela NSP4, com aumento da ativação da caspase 9 em 0,22% após 24 h de transfecção e a ativação da caspase 3 em de 0,42 e 0,40% após 48 e 72 h de transfecção, respectivamente. A NSP4 também ativou a via de apoptose independente de caspase, indicada pelo aumento de AIF em 0,49% após 72 h de transfecção. Adicionalmente, a NSP4 causou a fragmentação e condensação nuclear após 24, 48 e 72 h de transfecção, com aumento de 6,64%; 4,54% e 7,89 %, respectivamente, indicando morte celular programada. Esses resultados destacam a influência das proteínas NSP4 e ORF9b do SARS-CoV-2 na função celular, com implicações importantes para a compreensão da patogênese viral e o desenvolvimento de possíveis estratégias terapêuticas.