Análise do secretoma do fungo termofílico Thermothielavioides terrestris: prospecção, expressão heteróloga e caracterizações biofísicas e bioquímicas de algumas enzimas

• Autor(a) principal: Mulinari, Evandro José
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-13052020-095131/
• topic: Thermothielavioides terrestris; Thermothielavioides terrestris; Bagaço de cana-de-açúcar; Expressão heteróloga; Heterologous expression; Secretoma; Secretome; Sugarcane bagasse

O desenvolvimento de enzimas que apresentam maior estabilidade térmica pode tornar o processo de hidrólise de biomassa mais econômico pelo aumento na taxa de hidrólise, diminuição da contaminação dos reatores e maior transferência de massa pela redução da viscosidade do meio. Dessa forma, foram conduzidos experimentos para prospecção e detecção de proteínas presentes no secretoma do fungo termofílico Thermothielavioides terrestris cultivado em diferentes fontes de carbono: bagaço de cana-de-açúcar in natura (SCBIN), explodido à vapor (SCBSE) e polpa Kraft branqueada de eucalipto (BEKP), utilizando a técnica de LC-MS/MS. As análises mostraram uma hidrolase de glicosídeo da família 3 (GH3) como a maior constituinte do secretoma em BEKP e uma GH7 contendo módulo de ligação ao carboidrato da família 1 para SCBSE e SCBIN. O conteúdo proteico em SCBIN mostrou um repertório de hemicelulases que representaram 8% do total da contagem de espectros normalizados em comparação a 4% em BEKP e SCBSE, refletindo o efeito da composição da biomassa na regulação das proteínas secretadas. As análises também revelaram a presença de mecanismos oxidativos na degradação da biomassa. A primeira componente da análise de PCA das CAZymes revelou que SCBSE e SCBIN são correlacionados negativamente e que o SCBSE é caracterizado pela intensa remodelagem da parede celular, o que parece estar relacionado a intensa atividade secretória, indicando que o SCBSE possui potencial como meio de autoindução. Em contrapartida, retem muitas enzimas adsorvidas, o que pode ser não produtivo como matéria-prima para obtenção de monossacarídeos. A análise estatística apontou as enzimas diferencialmente secretadas no secretoma e que foram escolhidas para expressão heteróloga. As enzimas TtCel7.2 e TtCel7.3 secretadas em fungo filamentoso e as enzimas TtXil43, TtAraf54, Tex e TtGal5 expressas em bactéria exibiram temperatura ótima acima de 50 ºC e pH ligeiramente ácido. TtCel7.2 e TtCel7.3 exibiram diferenças de atividade e estabilidade térmica com 80% de atividade após 3 horas de incubação à 65 ºC.