Bioprospecção, estudos bioquímicos de enzimas oxidativas e seu sinergismo com celulases na hidrólise de biopolímeros

• Autor(a) principal: Leite, Ana Elisa Tognoli
• Data de Publicação: 2017
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-20092017-111725/
• topic: Auxiliary activities enzymes; Biocombustíveis; Biofuels; Enzimas acessórias; Prospecção; Prospecting; Sinergismo; Synergism

A demanda por fontes renováveis de energia juntamente com o esgotamento das reservas de combustíveis fósseis e do aquecimento global tem despertado grande interesse. A degradação da biomassa lignocelulósica para a produção de biocombustíveis tem se revelado uma alternativa viável, contudo tem enfrentado desafios em função de sua recalcitrância. Novos preparados enzimáticos envolvendo não só celulases com mecanismo hidrolítico, mas também proteínas com atividade auxiliares têm sido desenvolvidas e comercializadas. Contudo a adição de enzimas oxidativas nestes coquetéis ainda é passível de desenvolvimento e otimização. Nesse âmbito, o objetivo desse trabalho foi analisar três possíveis abordagens para a resolução desse problema. A primeira através do isolamento de fungos filamentosos de compostagem com o intuito de obter novas enzimas com função oxidativa. A segunda, constituiu o estudo de sinergismo de uma enzima acessória da família GH43 com o coquetel enzimático industrial Accellerase e a terceira no estudo da enzima oxidativa monooxigenases lítica de polissacarídeo (Lpmo) assim como sua interação sinérgica com uma endoglucanase de Trichoderma harzianum. A atividade celulolítica dos fungos foi determinada por análise do halo hidrolítico, assim como por reações enzimáticas utilizando substratos específicos. Os potenciais fungos produtores de enzimas oxidativas foram identificados por amplificação e sequenciamento da região ITS3. Dezesseis fungos foram isolados e testados, destes três apresentaram atividade positiva para a enzima lacase. O sequenciamento revelou que todos os fungos pertencem à mesma espécie patogênica Scedosporium prolificans, A enzima BlAbn1 (GH43) foi expressa em células de E. coli (BL21) e purificada para análise do sinergismo com o coquetel enzimático Accellerase em diferentes condições como sinergismo sequencial ou simultâneo, diferentes pH´s, tempo de reação e concentração enzimática. No sinergismo simultâneo e análises em pH 5 e pH 8 a taxa de sinergismo encontrada foi muito baixa apenas 4 %. Contudo no sinergismo sequencial com diferentes tempos e concentrações enzimáticas foi encontrado um aumento de 30 % na liberação de açúcares redutores na reação de 20 horas, mostrando que há ação sinérgica. O estudo da enzima oxidativa Lpmo foi realizado utilizando a enzima purificada após expressão heteróloga em Aspergillus nidulans. Análises com diferentes substratos e doadores de elétrons assim como sinergismo com uma endoglucanases foram realizados. Ácido ascórbico e pirogalol apresentaram-se como doadores de elétrons utilizando celulose amorfa (PASC), xilano e arabinoxilano como substratos. Ação sinérgica entre a endoglucanase e Lpmo foi observada, apresentando um aumento na liberação de açúcares redutores na ordem de 15 %. Em habitats naturais os microrganismos produtores de enzimas hidrolíticas e auxiliares apresentam ação sinérgica como demonstrado para enzimas da família GH43 com coquetéis enzimáticos e de enzimas oxidativas com endoglucanases. Este efeito pode ser explorado e utilizado na melhora da composição dos coquetéis enzimáticos dedicados á produção de biocombustíveis lignocelulósicos.