Expressão e purificação da quinase dependente de ciclina 13 humana em sistema bacteriano

• Autor(a) principal: Moreira, Juliana
• Data de Publicação: 2014
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/75/75133/tde-28082014-135313/
• topic: CDK13; CDK13; controle transcricional; fosforilação; phosphorylation; transcriptional control

As quinases dependentes de ciclinas são proteínas que podem ser divididas de acordo com a sua atuação no ciclo celular ou no controle transcricional, elas se tornam ativas em determinadas etapas do ciclo celular dependendo do seu grau de fosforilação e de sua ligação com ciclinas e proteínas inibitórias, e exercem sua função fosforilando outras proteínas envolvidas no ciclo de divisão celular e transcrição influenciando suas atividades, garantindo que cada processo do ciclo ocorra em uma sequência ordenada. A CDK13 faz parte da família de proteínas quinases dependentes de ciclina, pode se ligar a ciclinas do tipo L ou K, regula os eventos de \"splicing\" alternativo, e interage com a proteína Tat do vírus HIV atuando como um possível fator de restrição, sendo que sua superexpressão diminui a produção de algumas proteínas virais suprimindo a produção do vírus. O DNA referente à CDK13 é replicado em células cancerosas, principalmente dos tipos hepático e cólon e reto, sendo um alvo para inibidores para tratamento de câncer. A fim de contribuir para o estudo dessa proteína, o projeto tem como objetivo expressá-la utilizando métodos de tecnologia de DNA recombinante. A sequência de DNA referente à CDK13 foi amplificada pela reação em cadeia da polimerase, após sua purificação, foi inserida no vetor pCR-Blunt e clonada em células de E. coli DH5α competentes. Porém, o DNA não foi liberado pela reação com as enzimas de restrição BamHI e NdeI. As bactérias Rosetta(DE3) transformadas com um plasmídeo sintético e crescidas em meio de auto-indução expressaram a CDK13. Após lise celular e purificação em coluna de Ni2+, a proteína foi detectada por Western Blot. Já as bactérias Rosetta(DE3) transformadas com o plasmídeo sintético modificado (o qual compreende a região do DNA que expressa o bolsão de ligação da CDK13), e induzidas em meio LB expressaram a CDK13, porém não foi possível purificá-la em coluna de afinidade ao Ni2+.