Padronização de um ensaio in vitro para triagem de fármacos anti-trypanosoma utilizando cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas

• Autor(a) principal: Portella, Diogo Crispim Nascimento
• Data de Publicação: 2018
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)
• Texto Completo: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/33025
• topic: Cardiomiócitos; Cardiotoxicidade; Trypanosoma cruzi; Cardiomyocytes; Cardiotoxicity; Trypanosoma cruzi

A doença de Chagas é causada pela infecção crônica pelo Trypanosoma cruzi e continua sendo um grave problema de saúde na América Latina. As opções terapêuticas para a doença de Chagas são limitadas, com apenas dois medicamentos aprovados para uso. A cardiotoxicidade não prevista nas fases de desenvolvimento de novas drogas é a maior causa de retirada de medicamentos do mercado. A utilização de cardiomiócitos humanos produzidos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSC-CM) pode auxiliar no desenvolvimento farmacológico através do estabelecimento de ensaios mais preditivos do que a utilização de linhagens imortalizadas ou células de animais. OBJETIVOS: Neste estudo utilizamos cardiomiócitos humanos produzidos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSC-CM), objetivando avaliar simultaneamente a atividade anti-Trypanosoma cruzi e a citotoxicidade de compostos químicos selecionados. MÉTODOS: Foram utilizados nos ensaios hiPSC-CM produzidos a partir da diferenciação celular de linhagens de células-tronco obtidas de três doadores. Três compostos previamente avaliados quanto à atividade anti-T. cruzi - BA5 (derivado do ácido betulínico), GT5A e GT5B (derivados tiazolidínicos) - foram avaliados, utilizando o benzonidazol como controle. As células foram infectadas com T. cruzi (cepa Y) e incubadas por 48 h com diluições seriadas dos compostos para determinação dos valores de EC50 e CC50. Medidas de toxicidade subletal, incluindo avaliação do citoesqueleto por coloração com faloidina, de mitocôndrias utilizando mitotracker e dosagens de BNP, marcador de estresse cardíaco, foram incluídas no ensaio. Análise multiparamétricas automatizadas foram realizadas no sistema Operetta HCS. RESULTADOS: A diferenciação de hiPSC em cardiomiócitos teve eficiência de 83% quanto à expressão de troponina T cardíaca. O benzonidazol apresentou EC50 = 6,1 M e CC50 > 100 M. O BA5 apresentou EC50 = 3,2 M e CC50 = 37 M, o GT5A apresentou EC50 = 1,9 M e CC50 = 87 M, enquanto que o GT5B apresentou EC50 = 0,08 M e CC50 = 27 M. Análises de toxicidade subletal revelaram uma redução da intensidade de fluorescência compatível com a toxicidade mitocondrial, observada pela coloração de mitotracker, para doxorrubicina e BA5 após 1 h de incubação, enquanto a biomassa mitocondrial estava aumentada 48 h após a incubação com os compostos. A redução na marcação de faloidina foi observada com BA5 e doxorrubicina após 48 h de incubação. Níveis aumentados de BNP foram observados com o tratamento com BA5. CONCLUSÃO: A utilização de hiPSC-CM no fluxo de trabalho de desenvolvimento de fármacos para a doença de Chagas pode auxiliar na identificação de novos compostos. O ensaio mostrou-se viável por permitir avaliar rapidamente a ação anti-T. cruzi dos compostos, além de parâmetros de cardiotoxicidade, que podem aumentar o valor preditivo dos testes. Novos estudos serão necessários para que este ensaio seja aprimorado e validado quanto ao seu poder preditivo.