Avaliação e desenvolvimento da RT-PCR em tempo real para a detecção do vírus Chikungunya

• Autor(a) principal: Rêgo, Tâmisa Morais
• Data de Publicação: 2017
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)
• Texto Completo: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/23741
• topic: Vírus Chikungunya; PCR em tempo Real; Diagnóstico; PCR Multiplex; Controle de Qualidade; Chikungunya virus; Real-time PCR; Diagnosis; Multiplex PCR; Quality Control; Vírus Chikungunya; isolamento & purificação; Reação em Cadeia da Polimerase Via Transcriptase Reversa; métodos; Diagnóstico; Reação em Cadeia da Polimerase Multiplex; Controle de Qualidade; Estudos de Avaliação; Vírus Chikungunya; genética; Febre de Chikungunya; diagnóstico; Sensibilidade e Especificidade; Distribuição por Idade e Sexo; Fatores Imunológicos

O vírus Chikungunya (CHIKV) atualmente é um dos arbovírus de grande relevância médica, associado a casos de morbidade e/ou mortalidade, principalmente no Brasil. Assim, este projeto objetivou a otimização (às condições locais) e implementação do sistema de transcrição reversa de parte do genoma viral, seguido de amplificação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-qPCR), com base no protocolo desenvolvido pelo Centers for Disease Control and Prevention (CDC). A RT-qPCR foi avaliada através de uma curva padrão utilizando um transcrito e o limite de detecção (LOD) foi de 39 cópias/μl. O RNA das amostras de soro do estudo foi extraído e a RT-qPCR foi realizada. Das 151 amostras testadas, 46,4% foram negativas e 53,6% foram positivas, com uma maior capacidade de detecção pela RT-qPCR entre 0-4 dias pós infecção, em comparação ao teste de captura da imunoglobulina M (IgM) (MAC-ELISA). Análises da carga viral foram conduzidas: variação entre 101 a 108 cópias/μl e viremia ≥103 cópias/μl foram observadas na maioria das amostras positivas (64,2%). Cargas virais ≥107 cópias/μl foram evidenciadas nas faixas criança e idoso. De 0-2 dias pós infecção, foram também detectadas altas cargas virais (≥107 cópias/μl) nas amostras positivas. O ensaio da RNAse P humana (RNP), controle endógeno, foi otimizado apresentando amplificações em todas as amostras do estudo. A RNP apresentou níveis praticamente constantes entre os dias pós infecção e também ao correlacionar com a carga viral dos indivíduos positivos. Um ensaio multiplex com detecção simultânea dos alvos CHIKV e RNP foi estabelecido e avaliado preliminarmente apresentando um LOD de 390 cópias/μl. Uma concordância percentual de 88,88% em comparação aos resultados da RT-qPCR simples foi observada, sem diferença estatística entre os testes (p=1). Pode-se concluir que ambos os testes (formato simples e multiplex) foram sensíveis, permitindo a detecção e quantificação do CHIKV, com potencial uso na rotina laboratorial.