Estudo dos perfis de N-glicosila????o da prolactina recombinante humana expressa em c??lulas humanas HEK293

• Autor(a) principal: SILVA, FELIPE D.
• Data de Publicação: 2018
• Tipo de documento: Dissertação
• Título da fonte: Repositório Institucional do IPEN
• Texto Completo: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/29634
• topic: embryonic cells; animal cells; kidneys; escherichia coli; glycosyl transferases; lth; gonadotropins; high-performance liquid chromatography

A prolactina humana (hPRL) ?? um horm??nio sintetizado pela hip??fise com in??meras fun????es tais como: lacta????o, reprodu????o e regula????o osm??tica. Este horm??nio ?? frequentemente dosado em casos de problemas na lacta????o, infertilidade, al??m de estudos que elucidam sua liga????o em alguns tipos de c??ncer (mama, pr??stata e ??tero). A hPRL ?? encontrada na forma n??o glicosilada (NG-hPRL) (23 kDa) e glicosilada (G-hPRL) (25 kDa), sendo a isoforma glicosilada um modelo ideal de an??lise de perfil de N-glicanos, j?? que possui um ??nico s??tio de glicosila????o localizado na Asparagina 31. A glicosila????o est?? relacionada diretamente ?? solubilidade, ?? estabilidade, ao enovelamento, ?? meia-vida e atividade biol??gica in vivo. As c??lulas de ov??rio de hamster chin??s (CHO) e as c??lulas embrion??rias de rim humano (HEK293) s??o os hospedeiros mais utilizados para express??o de prote??nas recombinantes, j?? que podem ser cultivadas em altas densidades e por possu??rem similaridade nas modifica????es p??s-traducionais. O objetivo foi expressar, purificar e realizar uma caracteriza????o f??sico-qu??mica e biol??gica da hPRL glicosilada de c??lulas HEK293, incluindo an??lise da estrutura de carboidratos. Para tanto, foi realizada uma transfec????o em c??lulas HEK293T (aderidas) com o vetor pcDNA 3.4-TOPO. Foi obtida uma express??o de 21,26 ?? 8,3 ??g/mL de hPRL no meio condicionado sem soro. A hPRL foi purificada por cromatografia de afinidade a metais imobilizados (IMAC), eluindo 92% da hPRL em uma ??nica fra????o que, analisada por HPSEC, apresentou pureza de 97%. O perfil de N-glicanos da amostra apresentou seis esp??cies, todas com termina????o em ??cido-si??lico, do tipo complexo, sendo bi, tri e tetra-anten??rias, com relativa predomin??ncia da esp??cie N2G2S1 (29,4%). A bioatividade in vitro da G-hPRL HEK293 demonstrou ser ??? 16 vezes menor que a G-hPRL produzida em c??lulas CHO.