Express??o de tireotrofina humana em c??lulas de embri??o de rim humano (HEK293)

• Autor(a) principal: SANTANA, PATRICIA M.
• Data de Publicação: 2016
• Tipo de documento: Dissertação
• Título da fonte: Repositório Institucional do IPEN
• Texto Completo: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/26947
• topic: animal cells; kidneys; embryonic cells; animal tissues; tissue cultures; recombinant dna; trh; thyroid; liberins; peptide hormones; protein engineering; glycoproteins; pituitary gland; carbohydrates; bioassay; labelled compounds; cations; chromatography; high-performance liquid chromatography; gamma spectrometers; beta spectrometers; spectrometers; pulse analyzers; nuclear engineering

Neste trabalho foi transfectada uma linhagem de c??lulas embrion??rias de rim humano (HEK293) com os genes das subunidades α e β da tireotrofina humana (hTSH), horm??nio glicoproteico secretado pela hip??fise. Ap??s 5 dias de cultivo obteve-se uma concentra????o de hTSH no meio condicionado de 0,95μg/mL. O material foi concentrado e purificado utilizando uma estrat??gia envolvendo duas etapas, uma cromatografia de troca cati??nica e uma cromatografia l??quida de alta efici??ncia (HPLC) de fase reversa, que permitiu uma recupera????o de 55% e uma pureza >90%. O produto purificado (hTSH-HEK) foi analisado e comparado a uma prepara????o comercial obtida em c??lulas CHO (hTSH-CHO) e a uma prepara????o hipofis??ria (hTSH-Pit). A identidade e a pureza do hTSH-HEK foram avaliadas por m??todos f??sicoqu??micos e imunol??gico (espectrometria de massa MALDI-TOF, HPLC de exclus??o molecular e de fase reversa, SDS-PAGE e ensaio imunoradiom??trico). A por????o glic??dica do hTSH-HEK foi avaliada pela an??lise do perfil dos N-glicanos e o comportamento biol??gico deste horm??nio foi avaliado por bioensaio in vivo e estudo farmacocin??tico. As 3 prepara????es apresentaram pureza equivalente (97%) e a massa molecular relativa do hTSH-HEK foi 2,1% menor do que a do hTSH-CHO e 2,7% maior do que a do hTSH-Pit. A maior hidrofobicidade relativa, avaliada por RP-HPLC, foi a do hTSH-HEK. Os N-glicanos identificados no hTSH-HEK foram do tipo complexo, apresentando predominantemente estruturas tri-anten??rias, enquanto no hTSH-CHO e no hTSH-Pit as estruturas bi-anten??rias foram predominantes. Foram detectadas diferen??as significativas relacionadas ?? composi????o dos carboidratos para estas prepara????es, um teor muito menor de ??cido si??lico e muito maior de fucose foram observados no hTSHHEK. Foi confirmada a atividade biol??gica das 3 prepara????es, sendo a bioatividade do hTSHHEK 39% e 16% inferior ?? do hTSH-CHO e hTSH-Pit, respectivamente. A meia-vida circulat??ria do hTSH-HEK foi menor (1,5 X) que a do hTSH-CHO e a do hTSH-Pit (1,2 X). De acordo com esses resultados o hTSH-HEK pode ser considerado uma alternativa vi??vel para aplica????es cl??nicas especialmente por sua origem humana e composi????o de carboidratos.