Express??o de tireotrofina humana em c??lulas de embri??o de rim humano (HEK293)
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Data de Publicação: | 2016 |
Tipo de documento: | Dissertação |
Título da fonte: | Repositório Institucional do IPEN |
Texto Completo: | http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/26947 |
Resumo: | Neste trabalho foi transfectada uma linhagem de c??lulas embrion??rias de rim humano (HEK293) com os genes das subunidades α e β da tireotrofina humana (hTSH), horm??nio glicoproteico secretado pela hip??fise. Ap??s 5 dias de cultivo obteve-se uma concentra????o de hTSH no meio condicionado de 0,95μg/mL. O material foi concentrado e purificado utilizando uma estrat??gia envolvendo duas etapas, uma cromatografia de troca cati??nica e uma cromatografia l??quida de alta efici??ncia (HPLC) de fase reversa, que permitiu uma recupera????o de 55% e uma pureza >90%. O produto purificado (hTSH-HEK) foi analisado e comparado a uma prepara????o comercial obtida em c??lulas CHO (hTSH-CHO) e a uma prepara????o hipofis??ria (hTSH-Pit). A identidade e a pureza do hTSH-HEK foram avaliadas por m??todos f??sicoqu??micos e imunol??gico (espectrometria de massa MALDI-TOF, HPLC de exclus??o molecular e de fase reversa, SDS-PAGE e ensaio imunoradiom??trico). A por????o glic??dica do hTSH-HEK foi avaliada pela an??lise do perfil dos N-glicanos e o comportamento biol??gico deste horm??nio foi avaliado por bioensaio in vivo e estudo farmacocin??tico. As 3 prepara????es apresentaram pureza equivalente (97%) e a massa molecular relativa do hTSH-HEK foi 2,1% menor do que a do hTSH-CHO e 2,7% maior do que a do hTSH-Pit. A maior hidrofobicidade relativa, avaliada por RP-HPLC, foi a do hTSH-HEK. Os N-glicanos identificados no hTSH-HEK foram do tipo complexo, apresentando predominantemente estruturas tri-anten??rias, enquanto no hTSH-CHO e no hTSH-Pit as estruturas bi-anten??rias foram predominantes. Foram detectadas diferen??as significativas relacionadas ?? composi????o dos carboidratos para estas prepara????es, um teor muito menor de ??cido si??lico e muito maior de fucose foram observados no hTSHHEK. Foi confirmada a atividade biol??gica das 3 prepara????es, sendo a bioatividade do hTSHHEK 39% e 16% inferior ?? do hTSH-CHO e hTSH-Pit, respectivamente. A meia-vida circulat??ria do hTSH-HEK foi menor (1,5 X) que a do hTSH-CHO e a do hTSH-Pit (1,2 X). De acordo com esses resultados o hTSH-HEK pode ser considerado uma alternativa vi??vel para aplica????es cl??nicas especialmente por sua origem humana e composi????o de carboidratos. |
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Maria Teresa de Carvalho Pinto RibelaSANTANA, PATRICIA M.20162016-12-22T16:39:39Z2016-12-22T16:39:39Zhttp://repositorio.ipen.br/handle/123456789/2694710.11606/D.85.2016.tde-05122016-160030Neste trabalho foi transfectada uma linhagem de c??lulas embrion??rias de rim humano (HEK293) com os genes das subunidades α e β da tireotrofina humana (hTSH), horm??nio glicoproteico secretado pela hip??fise. Ap??s 5 dias de cultivo obteve-se uma concentra????o de hTSH no meio condicionado de 0,95μg/mL. O material foi concentrado e purificado utilizando uma estrat??gia envolvendo duas etapas, uma cromatografia de troca cati??nica e uma cromatografia l??quida de alta efici??ncia (HPLC) de fase reversa, que permitiu uma recupera????o de 55% e uma pureza >90%. O produto purificado (hTSH-HEK) foi analisado e comparado a uma prepara????o comercial obtida em c??lulas CHO (hTSH-CHO) e a uma prepara????o hipofis??ria (hTSH-Pit). A identidade e a pureza do hTSH-HEK foram avaliadas por m??todos f??sicoqu??micos e imunol??gico (espectrometria de massa MALDI-TOF, HPLC de exclus??o molecular e de fase reversa, SDS-PAGE e ensaio imunoradiom??trico). A por????o glic??dica do hTSH-HEK foi avaliada pela an??lise do perfil dos N-glicanos e o comportamento biol??gico deste horm??nio foi avaliado por bioensaio in vivo e estudo farmacocin??tico. As 3 prepara????es apresentaram pureza equivalente (97%) e a massa molecular relativa do hTSH-HEK foi 2,1% menor do que a do hTSH-CHO e 2,7% maior do que a do hTSH-Pit. A maior hidrofobicidade relativa, avaliada por RP-HPLC, foi a do hTSH-HEK. Os N-glicanos identificados no hTSH-HEK foram do tipo complexo, apresentando predominantemente estruturas tri-anten??rias, enquanto no hTSH-CHO e no hTSH-Pit as estruturas bi-anten??rias foram predominantes. Foram detectadas diferen??as significativas relacionadas ?? composi????o dos carboidratos para estas prepara????es, um teor muito menor de ??cido si??lico e muito maior de fucose foram observados no hTSHHEK. Foi confirmada a atividade biol??gica das 3 prepara????es, sendo a bioatividade do hTSHHEK 39% e 16% inferior ?? do hTSH-CHO e hTSH-Pit, respectivamente. A meia-vida circulat??ria do hTSH-HEK foi menor (1,5 X) que a do hTSH-CHO e a do hTSH-Pit (1,2 X). De acordo com esses resultados o hTSH-HEK pode ser considerado uma alternativa vi??vel para aplica????es cl??nicas especialmente por sua origem humana e composi????o de carboidratos.Submitted by Marco Antonio Oliveira da Silva (maosilva@ipen.br) on 2016-12-22T16:39:39Z No. of bitstreams: 0Made available in DSpace on 2016-12-22T16:39:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0Disserta????o (Mestrado em Tecnologia Nuclear)IPEN/DInstituto de Pesquisas Energ??ticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP64animal cellskidneysembryonic cellsanimal tissuestissue culturesrecombinant dnatrhthyroidliberinspeptide hormonesprotein engineeringglycoproteinspituitary glandcarbohydratesbioassaylabelled compoundscationschromatographyhigh-performance liquid chromatographygamma spectrometersbeta spectrometersspectrometerspulse analyzersnuclear engineeringExpress??o de tireotrofina humana em c??lulas de embri??o de rim humano (HEK293)Human tryrotropin expression in human embrionic kidney cells (HEK293)info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisNS??o Pauloinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional do IPENinstname:Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN)instacron:IPEN22025T577.17 A231eSANTANA, PATRICIA M.16-12http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/85/85131/tde-05122016-160030/pt-br.php11266SANTANA, PATRICIA M.:11266:810:SLICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; charset=utf-81748http://repositorio.ipen.br/bitstream/123456789/26947/1/license.txt8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33MD51123456789/269472020-09-10 21:50:31.23oai:repositorio.ipen.br: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Repositório InstitucionalPUBhttp://repositorio.ipen.br/oai/requestbibl@ipen.bropendoar:45102020-09-10T21:50:31Repositório Institucional do IPEN - Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN)false |
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