The role of Dmrt2 in the establishment of left-right asymmetry in the chick embryo

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Castro, Henrique Caldevilla Sentieiro Lyon de
Data de Publicação: 2015
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/22251
Resumo: Tese de mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015
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spelling The role of Dmrt2 in the establishment of left-right asymmetry in the chick embryoEixo esquerdo-direitoAssimetriaDmrt2GalinhaTeses de mestrado - 2015Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015Durante o desenvolvimento, diferentes eventos acontecem ao longo dos eixos de um embrião, para que um individuo adulto seja formado. Estes eventos podem dividir-se em dois tipos: (1) Eventos simétricos; (2) Eventos assimétricos. Um dos eventos simétricos chave é a somitogénese. A somitogénese é o processo pelo qual temos iniciação da segmentação do sistema músculo-esquelético, através da formação dos sómitos, segmentos mesodérmicos transitórios. Este processo de segmentação ocorre progressivamente na mesoderme pré-somítica, numa direcção anterior para posterior. Os pares de sómitos formam-se ao mesmo tempo dos dois lados e sempre com a mesma periodicidade segundo o modelo, proposto em 1976 por Cooke and Zeeman, “Clock and Wavefront model”. Este modelo supõe a existência de uma interacção de factores, cuja produção é cíclica, que marca o “tempo” que as células passam numa zona indeterminada da mesoderme paraxial. Associada a esta ciclicidade de factores encontra-se-ía ainda um gradiente de um outro factor, distinto dos primeiros, que seria responsável por determinar o espaço onde se dá a maturação das células. Quando as células atingem uma determinada região do gradiente, estas interpretariam a combinação de ambos os sinais como informação para se diferenciarem e aglomerarem, formando um novo sómito. Um conjunto de eventos que se enquadra no ponto (2), é o da formação e organização dos órgãos internos. Um exemplo clássico é o da formação do coração, que está localizado no lado esquerdo do organismo (no direito no caso da galinha) e que sofre uma torção de maneira a que as aurículas fiquem em cima e os ventrículos em baixo. Outro exemplo é o da formação das vísceras que, de maneira a ficarem alojadas correctamente na cavidade abdominal, têm que sofrer uma série de rotações. Todos estes processos assimétricos têm como base um conjunto de mecanismos que distribui, assimetricamente várias moléculas sinalizadoras, entre eles Shh, Wnts e FGFs, que vão controlar uma cadeia genética altamente conservada entre espécies. Hoje em dia sabe-se que este conjunto de mecanismos, iniciadores de assimetria, são variados e que apresentam algum grau de conservação entre espécies, actuando em diferentes tempos do desenvolvimento. Alguns destes mecanismos são: (1) A distribuição assimétrica de iões Ca2+, antes da gastrulação; (2) Estabelecimento de um gradiente assimétrico de determinantes via cílios, presentes no organizador, durante a gastrulação; (3) Expressão diferencial de uma cadeia de genes durante a formação de sómitos. Esta cadeia é a cadeia de Nodal-Pitx2, que se sabe ser assimétrica, tendo expressão no lado esquerdo do embrião. Sabe-se no entanto que os processos de simetria e assimetria, que formam um individuo adulto, ocorrem ao mesmo tempo, pelo que é necessário um, ou vários, mediadores para que a informação seja transmitida corretamente para as diferentes vias. Uma incorreta transmissão desta informação induz graves problemas no correcto posicionamento das diferentes estruturas que constituem um organismo, pelo que, uma boa compreensão dos eventos que coordenam as diferentes vias, é necessária. Um dos mediadores é o ácido retinóico (RA), que é a versão oxidada e activa da vitamina A. Estudos revelaram que de facto o RA tem um papel importante na protecção dos sómitos contra sinais assimétricos, uma vez que a sua inibição leva a graves problemas na formação dos sómitos, observando-se uma distribuição assimétrica de expressão génica. Um destes genes é o lunatic fringe (Lfng), que faz parte do “relógio molecular” da somitogénese, e está envolvido na diferenciação dos sómitos. Mais recentemente foi descoberto um novo efector nesta via de protecção. Este efector é o factor de transcrição Dmrt2. Este factor de transcrição, embora pertença a uma família maioritariamente associada à determinação sexual, não só é necessário para a formação simétrica dos sómitos, como é para o correcto estabelecimento da assimetria esquerda-direita. O seu papel exacto nas vias responsáveis por estes eventos, ainda é vastamente desconhecido, pelo que um estudo detalhado sobre este factor de transcrição é necessário. O objectivo deste projeto seria aprofundar o nosso conhecimento relativamente ao papel do Dmrt2 na formação de estruturas simétricas e assimétricas ao longo do desenvolvimento. Para que tal fosse possível iria ser utilizado o embrião de galinha como modelo, uma vez que este é o modelo em que menos se conhece o papel do Dmrt2, pelo que a importância de estudos neste organismo é maior. Para que estas funções sejam desvendadas, iriam ser feitas experiências de ganho de função, através da electroporação do Dmrt2, clonado no vector de expressão pGAGGS, em embriões de galinha no estádio HH3+ e em cultura New, para perceber qual o seu papel na padronização esquerda-direita. Tal não foi possível pois durante o processo de clonagem percebemos que a região a 5’ do gene não estava bem anotada, pelo que o desenho de primers forward era impossível. Ainda foi tentada uma 5’-RACE (técnica de amplificação de extremidades de DNA), para obter a região 5’, mas sem sucesso. Para perceber quais os genes que estariam a regular a sua atividade, partimos para uma abordagem de “gene candidato”. Para tal foram feitas manipulações na sinalização de sonic hedgehog (Shh), uma vez que este gene tem a mesma expressão que Dmrt2 mas mais cedo no desenvolvimento. Estas manipulações foram realizadas pondo uma solução de ciclopamina, inibidor da via de sinalização de Shh, in ovo, em embriões por volta do estádio HH4. Para ver se a expressão de Dmrt2 era afectada, realizamos hibridações in situ para o Dmrt2, com uma sonda produzida por nós em laboratório, através de plasmídeos infectados com uma porção do Dmrt2, que já tinha sido isolada, no âmbito de um projecto anterior. Apesar de se terem utilizado concentrações diferentes de droga, não se notou diferenças significativas na expressão entre embriões manipulados versus controlo. Tendo em conta estes resultados propomos que a abordagem futura a seguir, será a de optimizar os protocolos usados, nomeadamente o da 5’-RACE, e o da inibição de sinalização hedgehog, via ciclopamina. Deveram ainda ser feitas experiências adicionais, após realizar a experiência de ganho de função, tais como ver a expressão de genes candidatos, que estejam a ser regulados via Dmrt2, e o registo do fenótipo observado. Este registo pode ter como parâmetros a posição de órgãos com disposição assimétrica, como por exemplo o coração.In order to form a well-developed body, different events need to happen. These events can be symmetric or asymmetric. An example of a symmetric event is the formation of the axial skeleton and it’s associated muscles. An asymmetric event is for instance the establishment of organ morphology and situs. It is known that these events happen in the same time window and in embryonic territories closely located. A well-coordinated set of pathways is therefore needed, otherwise an incorrect transfer of information occurs, leading to serious problems in both somite and organ formation and positioning. It was shown that in zebrafish, Dmrt2a, a transcription factor of the DM domain family, protects the somites from asymmetric signals and conveys asymmetric signals to place the heart. It is known that zebrafish dmrt2a/terra is expressed in the anterior region of the PSM and somites. In addition, our lab detected dmrt2a/terra transcripts in the zebrafish KV from the 3-somite stage until the 10-somite stage, showing that this transcription factor has a function in the transition of information from the KV to the LPM. This transcription factor was also shown to have an asymmetric expression in the chicken’s Hensen’s node and a symmetric expression in the somites, although its function in this embryo has not been accessed.. In this study we tried to assess the role of the Dmrt2 in the establishment of left-right asymmetry in the chick embryo. We tried to clone the full length of dmrt2, by standard PCR and by 5’-RACE, in order to do experiments of gain-of-function, but without success. After this we tried to understand if Sonic hedgehog (Shh) is regulating the asymmetric expression of Dmrt2 in the chicken node, by inhibiting Hedgehog signalling, with different concentrations of cyclopamine, a drug that inhibits Patched. In situ hybridizations were done in order to understand if Dmrt2 expression was downregulated when Hedgehog signaling was inhibited. No conclusive results were obtained. The lack of results and the technical hurdles will be discussed and future experiments and expected results will be presented.Saúde, Maria Leonor TavaresThorsteinsdóttir, Sólveig,1962-Repositório da Universidade de LisboaCastro, Henrique Caldevilla Sentieiro Lyon de2016-01-04T16:21:39Z201520152015-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/22251TID:201373610enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:09:15Zoai:repositorio.ul.pt:10451/22251Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:39:52.405074Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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