Estudo de competição entre substratos de bombas de efluxo em isolados clínicos de Escherichia coli por fluorimetria em tempo real usando Vermelho do Nilo
Autor(a) principal: | |
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Data de Publicação: | 2022 |
Tipo de documento: | Dissertação |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10362/146124 |
Resumo: | As bombas de efluxo do tipo AcrAB-TolC são as que mais contribuem para a resistência aos antimicrobianos em Escherichia coli dada a grande variedade de substratos que conseguem efluxar. Existem vários métodos fluorométricos que permitem avaliar a atividade de bombas de efluxo, no entanto, nenhum consegue avaliar a possível existência de competição entre substratos. Assim, neste trabalho pretendemos otimizar um método de avaliação da competição entre substratos de bombas de efluxo do tipo AcrAB-TolC de E. coli. Para tal, usámos o corante lipofílico vermelho do Nilo como fluoróforo/competidor, o condutor energético carbonil cyanide-m-chlorophenylhydrazone (CCCP) para desenergizar as células bacterianas e a glucose como fornecedor de energia. Foram testados como possíveis competidores vários compostos conhecidos por serem substratos desta bomba de efluxo, assim como conhecidos inibidores das mesmas como a clorpromazina (CPZ) e phe-arg-β-naphthylamide (PAβN). A avaliação de competição de substratos foi realizada em nove estirpes de E. coli: três estirpes isogénicas que diferem entre si no sistema de efluxo AcrAB-TolC (AG100, que tem este sistema intacto e funcional; AG100A, com este sistema inativado; e AG100TET com este sistema sobreexpresso); a estirpe de referência ATCC25922; e cinco estirpes clínicas com diferentes genótipos e fenótipos, provenientes de pacientes com infeção no trato urinário e recolhidas em três hospitais da região de Lisboa. Todos os compostos foram testados em quatro concentrações diferentes baseadas na sua concentração mínima inibitória (CMI) para cada estirpe, e esta foi determinada pelo método de microdiluição seriada em placas de 96 poços usando o meio Mueller-Hinton. Quando um composto é capaz de interferir na acumulação de vermelho do Nilo, apresenta um nível de competição para a bomba de fluxo, assim, podemos por como hipóteses: (i) se a acumulação de vermelho do Nilo produzida for a mesma que a do substrato, então, provavelmente, estão a ser efluxados por diferentes bombas de efluxo; (ii) se os níveis de acumulação de vermelho do Nilo forem aumentados na presença de determinado substrato, provavelmente estão a competir pelo mesmo local de ligação na bomba; (iii) se os níveis de efluxo de vermelho do Nilo aumentarem, o substrato estará ligado noutro local na bomba, havendo a preferência para efluxar vermelho do Nilo. Com este trabalho podemos concluir que o CCCP promove a acumulação de vermelho do Nilo e dos restantes compostos por inibição da força motriz protónica; a glucose reenergiza as células promovendo assim a ativação das bombas de efluxo; todos os compostos tiveram algum efeito (aumento ou diminuição do efluxo de vermelho do Nilo) dependendo da sua concentração e da estirpe em teste; vermelho do Nilo pode ser usado como fluoróforo na avaliação de competição de substratos de bombas de efluxo em E. coli; e o método utilizado consegue avaliar a competição entre substratos de bombas de efluxo. Este trabalho tem implicações no estudo e caracterização de bombas de efluxo, em geral, bem como na descoberta de novos antimicrobianos. |
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Estudo de competição entre substratos de bombas de efluxo em isolados clínicos de Escherichia coli por fluorimetria em tempo real usando Vermelho do NiloMicrobiologia médicaBiologia molecularEscherichia coliVermelho do NiloDomínio/Área Científica::Ciências MédicasAs bombas de efluxo do tipo AcrAB-TolC são as que mais contribuem para a resistência aos antimicrobianos em Escherichia coli dada a grande variedade de substratos que conseguem efluxar. Existem vários métodos fluorométricos que permitem avaliar a atividade de bombas de efluxo, no entanto, nenhum consegue avaliar a possível existência de competição entre substratos. Assim, neste trabalho pretendemos otimizar um método de avaliação da competição entre substratos de bombas de efluxo do tipo AcrAB-TolC de E. coli. Para tal, usámos o corante lipofílico vermelho do Nilo como fluoróforo/competidor, o condutor energético carbonil cyanide-m-chlorophenylhydrazone (CCCP) para desenergizar as células bacterianas e a glucose como fornecedor de energia. Foram testados como possíveis competidores vários compostos conhecidos por serem substratos desta bomba de efluxo, assim como conhecidos inibidores das mesmas como a clorpromazina (CPZ) e phe-arg-β-naphthylamide (PAβN). A avaliação de competição de substratos foi realizada em nove estirpes de E. coli: três estirpes isogénicas que diferem entre si no sistema de efluxo AcrAB-TolC (AG100, que tem este sistema intacto e funcional; AG100A, com este sistema inativado; e AG100TET com este sistema sobreexpresso); a estirpe de referência ATCC25922; e cinco estirpes clínicas com diferentes genótipos e fenótipos, provenientes de pacientes com infeção no trato urinário e recolhidas em três hospitais da região de Lisboa. Todos os compostos foram testados em quatro concentrações diferentes baseadas na sua concentração mínima inibitória (CMI) para cada estirpe, e esta foi determinada pelo método de microdiluição seriada em placas de 96 poços usando o meio Mueller-Hinton. Quando um composto é capaz de interferir na acumulação de vermelho do Nilo, apresenta um nível de competição para a bomba de fluxo, assim, podemos por como hipóteses: (i) se a acumulação de vermelho do Nilo produzida for a mesma que a do substrato, então, provavelmente, estão a ser efluxados por diferentes bombas de efluxo; (ii) se os níveis de acumulação de vermelho do Nilo forem aumentados na presença de determinado substrato, provavelmente estão a competir pelo mesmo local de ligação na bomba; (iii) se os níveis de efluxo de vermelho do Nilo aumentarem, o substrato estará ligado noutro local na bomba, havendo a preferência para efluxar vermelho do Nilo. Com este trabalho podemos concluir que o CCCP promove a acumulação de vermelho do Nilo e dos restantes compostos por inibição da força motriz protónica; a glucose reenergiza as células promovendo assim a ativação das bombas de efluxo; todos os compostos tiveram algum efeito (aumento ou diminuição do efluxo de vermelho do Nilo) dependendo da sua concentração e da estirpe em teste; vermelho do Nilo pode ser usado como fluoróforo na avaliação de competição de substratos de bombas de efluxo em E. coli; e o método utilizado consegue avaliar a competição entre substratos de bombas de efluxo. Este trabalho tem implicações no estudo e caracterização de bombas de efluxo, em geral, bem como na descoberta de novos antimicrobianos.The AcrAB-TolC efflux pump complex acts as the major contributor to the multidrug resistance in Escherichia coli given the variety of substrates that can export. There are several fluorometric methods that allow the study of its activity, however, none can assess the possible existence of competition between substrates. Therefore, in this work we intend to optimize a competition assay for the evaluation of competition between E. coli AcrAB-TolC efflux pump substrates. For this, we used the lipophilic Nile red dye as a fluorophore/competitor, the energy conductor cyanide-m-chlorophenylhydrazone (CCCP) to deenergize the bacterial cells and glucose as the energy source. Several compounds known to be substrates of this efflux pump were tested as possible competitors, as well as known inhibitors such as chlorpromazine (CPZ) and phe-arg-β-naphthylamide (PAβN). The evaluation of substrate competition was performed in nine E. coli strains: three isogenic strains that differ from each other in the AcrAB-TolC efflux system (AG100, which has this system intact and functional; AG100A, whit this system inactivated; and AG100TET, with this system over-expressed); the reference strain ATCC 25922 and five clinical strains with different genotypes and phenotypes, originating form patients with urinary tract infections and collected in three hospitals in the Lisbon area. All compounds were tested at four different concentrations based on their minimum inhibitory concentration (MIC) for each strain, and this was determined by serial microdilution method in 96-well plates using Mueller-Hinton medium. When a compound is capable of interfering with the accumulation of Nile red, it presents a level of competition for the efflux pump, thus, we can assume as hypotheses: (i) if the Nile red accumulation produced is the same as that of the substrate, then probably are being effluxed by different efflux pumps; (ii) if Nile red accumulation levels are increased in the presence of a certain substrate, they are likely competing for the same binding site in the pump; (iii) if Nile red efflux levels increase, the substrate will be bound elsewhere in the pump, with a preference for Nile red efflux. With this work we can conclude that CCCP promotes the accumulation of Nile red and the other compounds by inhibition of the proton motive force; glucose reenergizes cells thus promoting activation of efflux pumps; all compounds had some effect (increase or decrease in Nile red efflux) depending on their concentration and the tested strain; Nile red can be used as a fluorophore in the evaluation of substrate competition from efflux pumps in E. coli; and the method used is able to evaluate the competition between substrates of efflux pumps. This work has implications for the study and characterization of efflux pumps, in general, as well as for the discovery of new antimicrobials.MACHADO, DianaVIVEIROS, MiguelRUNMAIA, Inês Lopes Pinheiro de Oliveira2022-062022-062022-06-01T00:00:00Z2025-06-18T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10362/146124TID:203111893porinfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2024-03-11T05:27:08Zoai:run.unl.pt:10362/146124Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-20T03:52:29.734800Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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Estudo de competição entre substratos de bombas de efluxo em isolados clínicos de Escherichia coli por fluorimetria em tempo real usando Vermelho do Nilo MAIA, Inês Lopes Pinheiro de Oliveira Microbiologia médica Biologia molecular Escherichia coli Vermelho do Nilo Domínio/Área Científica::Ciências Médicas |
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