Estudo de competição entre substratos de bombas de efluxo em isolados clínicos de Escherichia coli por fluorimetria em tempo real usando Vermelho do Nilo

• Autor(a) principal: MAIA, Inês Lopes Pinheiro de Oliveira
• Data de Publicação: 2022
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10362/146124
• topic: Microbiologia médica; Biologia molecular; Escherichia coli; Vermelho do Nilo; Domínio/Área Científica::Ciências Médicas

As bombas de efluxo do tipo AcrAB-TolC são as que mais contribuem para a resistência aos antimicrobianos em Escherichia coli dada a grande variedade de substratos que conseguem efluxar. Existem vários métodos fluorométricos que permitem avaliar a atividade de bombas de efluxo, no entanto, nenhum consegue avaliar a possível existência de competição entre substratos. Assim, neste trabalho pretendemos otimizar um método de avaliação da competição entre substratos de bombas de efluxo do tipo AcrAB-TolC de E. coli. Para tal, usámos o corante lipofílico vermelho do Nilo como fluoróforo/competidor, o condutor energético carbonil cyanide-m-chlorophenylhydrazone (CCCP) para desenergizar as células bacterianas e a glucose como fornecedor de energia. Foram testados como possíveis competidores vários compostos conhecidos por serem substratos desta bomba de efluxo, assim como conhecidos inibidores das mesmas como a clorpromazina (CPZ) e phe-arg-β-naphthylamide (PAβN). A avaliação de competição de substratos foi realizada em nove estirpes de E. coli: três estirpes isogénicas que diferem entre si no sistema de efluxo AcrAB-TolC (AG100, que tem este sistema intacto e funcional; AG100A, com este sistema inativado; e AG100TET com este sistema sobreexpresso); a estirpe de referência ATCC25922; e cinco estirpes clínicas com diferentes genótipos e fenótipos, provenientes de pacientes com infeção no trato urinário e recolhidas em três hospitais da região de Lisboa. Todos os compostos foram testados em quatro concentrações diferentes baseadas na sua concentração mínima inibitória (CMI) para cada estirpe, e esta foi determinada pelo método de microdiluição seriada em placas de 96 poços usando o meio Mueller-Hinton. Quando um composto é capaz de interferir na acumulação de vermelho do Nilo, apresenta um nível de competição para a bomba de fluxo, assim, podemos por como hipóteses: (i) se a acumulação de vermelho do Nilo produzida for a mesma que a do substrato, então, provavelmente, estão a ser efluxados por diferentes bombas de efluxo; (ii) se os níveis de acumulação de vermelho do Nilo forem aumentados na presença de determinado substrato, provavelmente estão a competir pelo mesmo local de ligação na bomba; (iii) se os níveis de efluxo de vermelho do Nilo aumentarem, o substrato estará ligado noutro local na bomba, havendo a preferência para efluxar vermelho do Nilo. Com este trabalho podemos concluir que o CCCP promove a acumulação de vermelho do Nilo e dos restantes compostos por inibição da força motriz protónica; a glucose reenergiza as células promovendo assim a ativação das bombas de efluxo; todos os compostos tiveram algum efeito (aumento ou diminuição do efluxo de vermelho do Nilo) dependendo da sua concentração e da estirpe em teste; vermelho do Nilo pode ser usado como fluoróforo na avaliação de competição de substratos de bombas de efluxo em E. coli; e o método utilizado consegue avaliar a competição entre substratos de bombas de efluxo. Este trabalho tem implicações no estudo e caracterização de bombas de efluxo, em geral, bem como na descoberta de novos antimicrobianos.