Desenvolvimento e otimização de um biossensor de infeções por Staphylococcus aureus usando proteínas recombinantes
Autor(a) principal: | |
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Data de Publicação: | 2022 |
Tipo de documento: | Dissertação |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10362/132851 |
Resumo: | Staphylococcus aureus é um agente patogénico oportunista com elevada capacidade de adaptação a diferentes ambientes, causando um número significativo de infeções, a nível hospitalar e na comunidade, com elevadas taxas de mortalidade e morbilidade. S. aureus tem também a capacidade de adquirir de terminantes de resistência aos antibióticos existentes, sendo dos agentes patogénicos mais importantes a nível clínico. Desta forma, são necessários métodos eficientes para a deteção de S. aureus, permitindo tratamento direcionado, e eliminando a utilização inapropriada de antibióticos. O objetivo desta tese foi o desenvolvimento de um biossensor, baseado na proteína Lisostafina, de forma a detetar especifica mente S. aureus, em amostras clínicas. A Lisostafina é composta por um domínio de ligação ao pepti doglicano, e um domínio catalítico, ambos com a capacidade de interagir com o peptidoglicano de S. aureus. Diferentes proteínas recombinantes foram construídas e sobre-expressas de forma a testar cada um dos domínios da Lisostafina, individualmente. O domínio catalítico associado a uma cisteína termi nal (Proteína Domínio Catalítico-Cys) demonstrou, relativamente às restantes proteínas recombinantes, elevada especificidade de ligação a células de S. aureus, não tendo capacidade de ligação às restantes espécies bacterianas testadas, e também capacidade hidrolítica reduzida comparativamente à Lisostafina ou ao Domínio Catalítico. Estas características levaram a que a proteína Domínio Catalítico-Cys fosse escolhida para utilização no biossensor. O protótipo do biossensor foi montado, através da imobilização da proteína num suporte de vidro e a deteção foi realizada usando cristal líquido nemático 5CB e um microscópio de luz polarizada. Este protótipo permitiu diferenciar S. aureus de Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus haemolyticus. No futuro, será avaliada a capacidade de deteção de muropéptidos, de diferentes microrganismos, e posteriormente, a funcionalidade do biossen sor na prática clínica, através do uso de amostras biológicas. |
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Desenvolvimento e otimização de um biossensor de infeções por Staphylococcus aureus usando proteínas recombinantesStaphylococcus aureusPeptidoglicanoLisostafinaDomínio CatalíticoBiossensorDomínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia::Outras Engenharias e TecnologiasStaphylococcus aureus é um agente patogénico oportunista com elevada capacidade de adaptação a diferentes ambientes, causando um número significativo de infeções, a nível hospitalar e na comunidade, com elevadas taxas de mortalidade e morbilidade. S. aureus tem também a capacidade de adquirir de terminantes de resistência aos antibióticos existentes, sendo dos agentes patogénicos mais importantes a nível clínico. Desta forma, são necessários métodos eficientes para a deteção de S. aureus, permitindo tratamento direcionado, e eliminando a utilização inapropriada de antibióticos. O objetivo desta tese foi o desenvolvimento de um biossensor, baseado na proteína Lisostafina, de forma a detetar especifica mente S. aureus, em amostras clínicas. A Lisostafina é composta por um domínio de ligação ao pepti doglicano, e um domínio catalítico, ambos com a capacidade de interagir com o peptidoglicano de S. aureus. Diferentes proteínas recombinantes foram construídas e sobre-expressas de forma a testar cada um dos domínios da Lisostafina, individualmente. O domínio catalítico associado a uma cisteína termi nal (Proteína Domínio Catalítico-Cys) demonstrou, relativamente às restantes proteínas recombinantes, elevada especificidade de ligação a células de S. aureus, não tendo capacidade de ligação às restantes espécies bacterianas testadas, e também capacidade hidrolítica reduzida comparativamente à Lisostafina ou ao Domínio Catalítico. Estas características levaram a que a proteína Domínio Catalítico-Cys fosse escolhida para utilização no biossensor. O protótipo do biossensor foi montado, através da imobilização da proteína num suporte de vidro e a deteção foi realizada usando cristal líquido nemático 5CB e um microscópio de luz polarizada. Este protótipo permitiu diferenciar S. aureus de Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus haemolyticus. No futuro, será avaliada a capacidade de deteção de muropéptidos, de diferentes microrganismos, e posteriormente, a funcionalidade do biossen sor na prática clínica, através do uso de amostras biológicas.Staphylococcus aureus is an opportunistic pathogen with high capacity to adapt to different environ ments, causing a significant number of infections, in hospitals and in the community, with high mortality and morbidity rates. S. aureus also has the capacity to acquire resistance to the existent antibiotics, being one of the most important pathogens in the clinic. Therefore, efficient methods to detect S. aureus in fections are needed, allowing for targeted treatment, and eliminating the misuse of antibiotics. The aim of this thesis was the development of a biosensor, based on Lysostaphin protein, to specifically detect S. aureus in clinical samples. Lysostaphin is composed of a peptidoglycan binding domain, and a cata lytic domain, and both can interact with the S. aureus peptidoglycan. Different recombinant proteins were constructed and overexpressed to test each Lysostaphin domain individually. The catalytic domain associated with a terminal cysteine (Catalytic Domain-Cys protein) showed binding specificity to S. aureus cells but did not bind to the remaining bacterial species tested, when compared to the other recombinant proteins. Furthermore, this protein demonstrated reduced hydrolytic capacity when com pared to Lysostaphin or the Catalytic Domain. Together, all these characteristics made this protein the best choice for the biosensor. The biosensor prototype was assembled by immobilizing Catalytic Do main-Cys protein on glass slides and detection was performed using 5CB nematic liquid crystal and a polarized optical microscope. This prototype allowed to differentiate S. aureus from Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus haemolyticus. In the future, the ability to detect muro peptides from different microorganisms, and later, the functionality of the biosensor in clinical practice, using biological samples, will be evaluated.Almeida, RitaGrilo, Maria InêsRUNGanhão, Pedro Miguel Reis2022-02-14T15:45:27Z2022-012022-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10362/132851porinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2024-03-11T05:11:31Zoai:run.unl.pt:10362/132851Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-20T03:47:36.831232Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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