Transfection efficiency of a vector for mitochondrial gene therapy

• Autor(a) principal: Salvado, Rúben Joel Bispo
• Data de Publicação: 2014
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10400.6/5550
• topic: Citopatias Mitocondriais; Nanopartículas; Terapia Génica Mitocondrial; Vetores Não Virais; Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia::Engenharia Química

Além de DNA no núcleo, as células também contêm DNA na mitocôndria (mtDNA). O mtDNA apresenta uma forma circular e codifica 13 proteínas, 2 rRNAs e 22 tRNAs que são exclusivos para este organelo. A mitocôndria tem diversas funções, entre as quais a produção de energia, produzindo a maior parte do ATP usado pelas células via respiração aeróbia. Durante a respiração celular, ocorre um processo de oxidação/redução produzindo eventualmente ROS, ou espécies reativas de oxigénio, que podem danificar não só a célula e os seus organelos, mas também o mtDNA. Devido à falta de mecanismos de proteção do conteúdo genético, a taxa de mutação do genoma mitocondrial é extremamente elevada quando comparada à taxa de mutação do genoma nuclear. Sabe-se atualmente que mutações no mtDNA estão ligadas a várias doenças, entre elas a diabetes, cancro, doença de Alzheimer e doença de Parkinson. Nenhuma destas doenças tem um tratamento eficaz, o que incentiva o estudo de novas terapias. A terapia génica, envolvendo a inserção de novos genes em mitocôndrias mutadas com vista a reestabelecer a sua função normal, oferece uma boa perspetiva de tratamento. A terapia génica para mutações mitocondriais ainda se encontra nas fases iniciais de estudo, não tendo ainda sido desenvolvido um método de entrega de material genético, à mitocôndria, suficientemente eficaz e livre de riscos. Esta dissertação focou-se no desenvolvimento de nanopartículas com afinidade pela mitocôndria para transporte de DNA plasmídico, assim como no desenvolvimento de um vetor incorporando o gene mitocondrial, ND1. O projeto foi dividido em três partes: 1. Isolamento e purificação do gene ND1, biossíntese dos plasmídeos pVAX1-LacZ, pcDNA3-myc-FLNa S2152A e pCAG-GFP e construção do vetor; 2. Produção e caracterização de nanopartículas de DNA plasmídico; 3. Estudos in vitro. O gene mitocondrial ND1, isolado de amostras de sangue humano, foi clonado com sucesso no plasmídeo pGEM®-T. Após a construção do vetor procedeu-se à transformação de Escherichia coli através do processo de transformação química. Este passo relevante tornou-se crucial nas etapas subsequentes de desenvolvimento de vetores de expressão com base em genes mitocondriais (investigação em curso). As nanopartículas foram produzidas usando um método de co-precipitação, produzindo partículas de carbonato de cálcio (CaCO3) incorporando o plasmídeo e rodamina 123, um composto fluorescente com afinidade mitocondrial. Parâmetros como a morfologia, tamanho, potencial ?, capacidade de encapsulação e biocompatibilidade foram analisados. Os resultados demonstraram que as nanopartículas têm características ideais para ensaios de transfeção celular, o que nos permitiu prosseguir com estudos in vitro em fibroblastos e células tumorais. Para avaliar a capacidade de direcionamento e entrega de DNA plasmídico à mitocôndria, procedeu-se à quantificação da proteína GFP expressa. Devido a diferenças no código genético, a proteína GFP não pode ser expressa na mitocôndria quando a transfeção celular é mediada por nanopartículas de pCAG-GFP contendo rodamina 123. A análise à fluorescência da rodamina nas células mostrou também que as nanopartículas se acumulavam na mitocôndria. Estes resultados foram ainda confirmados por microscopia confocal, nomeadamente, por estudos de co-localização a duas e três dimensões. Assim, nesta dissertação é apresentado um novo vetor não viral com afinidade pela mitocôndria bem como avanços importantes na clonagem de um gene mitocondrial. O conhecimento adquirido, em muito, contribui para a evolução de protocolos de terapia génica mitocondrial motivando a investigação de novos tratamentos para as doenças mitocondriais.