Transfection efficiency of a vector for mitochondrial gene therapy
Autor(a) principal: | |
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Data de Publicação: | 2014 |
Tipo de documento: | Dissertação |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10400.6/5550 |
Resumo: | Além de DNA no núcleo, as células também contêm DNA na mitocôndria (mtDNA). O mtDNA apresenta uma forma circular e codifica 13 proteínas, 2 rRNAs e 22 tRNAs que são exclusivos para este organelo. A mitocôndria tem diversas funções, entre as quais a produção de energia, produzindo a maior parte do ATP usado pelas células via respiração aeróbia. Durante a respiração celular, ocorre um processo de oxidação/redução produzindo eventualmente ROS, ou espécies reativas de oxigénio, que podem danificar não só a célula e os seus organelos, mas também o mtDNA. Devido à falta de mecanismos de proteção do conteúdo genético, a taxa de mutação do genoma mitocondrial é extremamente elevada quando comparada à taxa de mutação do genoma nuclear. Sabe-se atualmente que mutações no mtDNA estão ligadas a várias doenças, entre elas a diabetes, cancro, doença de Alzheimer e doença de Parkinson. Nenhuma destas doenças tem um tratamento eficaz, o que incentiva o estudo de novas terapias. A terapia génica, envolvendo a inserção de novos genes em mitocôndrias mutadas com vista a reestabelecer a sua função normal, oferece uma boa perspetiva de tratamento. A terapia génica para mutações mitocondriais ainda se encontra nas fases iniciais de estudo, não tendo ainda sido desenvolvido um método de entrega de material genético, à mitocôndria, suficientemente eficaz e livre de riscos. Esta dissertação focou-se no desenvolvimento de nanopartículas com afinidade pela mitocôndria para transporte de DNA plasmídico, assim como no desenvolvimento de um vetor incorporando o gene mitocondrial, ND1. O projeto foi dividido em três partes: 1. Isolamento e purificação do gene ND1, biossíntese dos plasmídeos pVAX1-LacZ, pcDNA3-myc-FLNa S2152A e pCAG-GFP e construção do vetor; 2. Produção e caracterização de nanopartículas de DNA plasmídico; 3. Estudos in vitro. O gene mitocondrial ND1, isolado de amostras de sangue humano, foi clonado com sucesso no plasmídeo pGEM®-T. Após a construção do vetor procedeu-se à transformação de Escherichia coli através do processo de transformação química. Este passo relevante tornou-se crucial nas etapas subsequentes de desenvolvimento de vetores de expressão com base em genes mitocondriais (investigação em curso). As nanopartículas foram produzidas usando um método de co-precipitação, produzindo partículas de carbonato de cálcio (CaCO3) incorporando o plasmídeo e rodamina 123, um composto fluorescente com afinidade mitocondrial. Parâmetros como a morfologia, tamanho, potencial ?, capacidade de encapsulação e biocompatibilidade foram analisados. Os resultados demonstraram que as nanopartículas têm características ideais para ensaios de transfeção celular, o que nos permitiu prosseguir com estudos in vitro em fibroblastos e células tumorais. Para avaliar a capacidade de direcionamento e entrega de DNA plasmídico à mitocôndria, procedeu-se à quantificação da proteína GFP expressa. Devido a diferenças no código genético, a proteína GFP não pode ser expressa na mitocôndria quando a transfeção celular é mediada por nanopartículas de pCAG-GFP contendo rodamina 123. A análise à fluorescência da rodamina nas células mostrou também que as nanopartículas se acumulavam na mitocôndria. Estes resultados foram ainda confirmados por microscopia confocal, nomeadamente, por estudos de co-localização a duas e três dimensões. Assim, nesta dissertação é apresentado um novo vetor não viral com afinidade pela mitocôndria bem como avanços importantes na clonagem de um gene mitocondrial. O conhecimento adquirido, em muito, contribui para a evolução de protocolos de terapia génica mitocondrial motivando a investigação de novos tratamentos para as doenças mitocondriais. |
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Transfection efficiency of a vector for mitochondrial gene therapyCitopatias MitocondriaisNanopartículasTerapia Génica MitocondrialVetores Não ViraisDomínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia::Engenharia QuímicaAlém de DNA no núcleo, as células também contêm DNA na mitocôndria (mtDNA). O mtDNA apresenta uma forma circular e codifica 13 proteínas, 2 rRNAs e 22 tRNAs que são exclusivos para este organelo. A mitocôndria tem diversas funções, entre as quais a produção de energia, produzindo a maior parte do ATP usado pelas células via respiração aeróbia. Durante a respiração celular, ocorre um processo de oxidação/redução produzindo eventualmente ROS, ou espécies reativas de oxigénio, que podem danificar não só a célula e os seus organelos, mas também o mtDNA. Devido à falta de mecanismos de proteção do conteúdo genético, a taxa de mutação do genoma mitocondrial é extremamente elevada quando comparada à taxa de mutação do genoma nuclear. Sabe-se atualmente que mutações no mtDNA estão ligadas a várias doenças, entre elas a diabetes, cancro, doença de Alzheimer e doença de Parkinson. Nenhuma destas doenças tem um tratamento eficaz, o que incentiva o estudo de novas terapias. A terapia génica, envolvendo a inserção de novos genes em mitocôndrias mutadas com vista a reestabelecer a sua função normal, oferece uma boa perspetiva de tratamento. A terapia génica para mutações mitocondriais ainda se encontra nas fases iniciais de estudo, não tendo ainda sido desenvolvido um método de entrega de material genético, à mitocôndria, suficientemente eficaz e livre de riscos. Esta dissertação focou-se no desenvolvimento de nanopartículas com afinidade pela mitocôndria para transporte de DNA plasmídico, assim como no desenvolvimento de um vetor incorporando o gene mitocondrial, ND1. O projeto foi dividido em três partes: 1. 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Os resultados demonstraram que as nanopartículas têm características ideais para ensaios de transfeção celular, o que nos permitiu prosseguir com estudos in vitro em fibroblastos e células tumorais. Para avaliar a capacidade de direcionamento e entrega de DNA plasmídico à mitocôndria, procedeu-se à quantificação da proteína GFP expressa. Devido a diferenças no código genético, a proteína GFP não pode ser expressa na mitocôndria quando a transfeção celular é mediada por nanopartículas de pCAG-GFP contendo rodamina 123. A análise à fluorescência da rodamina nas células mostrou também que as nanopartículas se acumulavam na mitocôndria. Estes resultados foram ainda confirmados por microscopia confocal, nomeadamente, por estudos de co-localização a duas e três dimensões. Assim, nesta dissertação é apresentado um novo vetor não viral com afinidade pela mitocôndria bem como avanços importantes na clonagem de um gene mitocondrial. O conhecimento adquirido, em muito, contribui para a evolução de protocolos de terapia génica mitocondrial motivando a investigação de novos tratamentos para as doenças mitocondriais.Besides DNA in the nucleus, cells also contain DNA in the mitochondria (mtDNA). This mtDNA encodes for 13 proteins, 2 rRNAs and 22 tRNAs, all exclusive to this organelle. Since their main function is the production of energy, any mutation in the mtDNA can cause serious diseases. The environment inside the mitochondria and the lack of protection of the mtDNA exacerbate the mutation rate of the mitochondrial genome. Mutations in the mtDNA have already been linked to various pathologies such as diabetes, cancer, Alzheimer's and Parkinson's diseases. Currently, no effective treatment exists for these mitochondrial cytopathies. The development of gene therapy to treat mtDNA disorders offers a promising approach, being a practical and potentially effective tool as it focuses in the actual cause of the disorder. This M.Sc. thesis focused on the development of a mitochondrial gene based plasmid DNA vector and plasmid DNA nanoparticle systems with the ability to target mitochondria. The project was divided in three main parts: 1. Isolation and purification of ND1 gene and biosynthesis of the plasmids pVAX1-LacZ, pcDNA3-myc-FLNa S2152A and pCAG-GFP and vector construction 2. Nanoparticle formulation and characterization 3. In vitro studies We were able to create a mitochondrial ND1 gene pGEM®-T plasmid vector, opening the way to the formulation of adequate human mitochondrial gene based carriers. Additionally, we developed novel rhodamine pDNA nanoparticles by a co-precipitation method. These pDNA vectors show a great biocompatibility and suitable size for gene therapy protocols. All rhodamine nanoparticles can be internalized in fibroblast and tumoral cells and target mitochondria. A three-dimensional analysis performed on Z plane confirms the internalization of rhodamine pDNA carriers into mitochondria. In addition, GFP protein inexpression reinforces mitochondrial-targeting ability; due to the different genetic code in mitochondria, GFP protein cannot be expressed. These results represent a promising new approach to the treatment of mitochondria associated diseases.Costa, Diana Rita BarataSousa, Fani Pereira deuBibliorumSalvado, Rúben Joel Bispo2018-07-31T14:39:55Z2014-10-32014-11-072014-11-07T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10400.6/5550TID:201327406porinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-12-15T09:43:34Zoai:ubibliorum.ubi.pt:10400.6/5550Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-20T00:46:26.308263Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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