Mecanismos da regulação transcricional de Rasgef1b, um gene induzível por receptores do tipo Toll

• Autor(a) principal: Felipe Batista Leão
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFMG
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/1843/30646; https://orcid.org/0000-0002-4130-8998
• topic: RasGEF1b; NF-kappa B; Promotor; Expressão Gênica; Biologia celular; Expressão Gênica; Fatores ras de Troca de Nucleotídeo Guanina; NF-kappa B

O fator de troca de nucleotídeos guanina RasGEF1b é codificado por um gene de expressão induzida em células do sistema imune inato em resposta à ativação de receptores do tipo Toll (TLRs). O acúmulo de seu mRNA ocorre em macrófagos humanos e murinos estimulados com diferentes agonistas de TLRs, assim como em camundongos infectados com protozoários parasitas, sugerindo que a proteína codificada desempenha uma função na resposta imune. No entanto, seu papel nesse contexto ainda não é totalmente compreendido. Além disso, os mecanismos transcricionais que regulam sua expressão são também desconhecidos, dada a ausência de estudos sobre o promotor e os potenciais elementos regulatórios envolvidos nesse processo. Uma vez que as diversas funções biológicas mediadas pelo módulo RasGEF–RasGTPase são, em parte, dependentes dos seus padrões de expressão em tipos celulares ou tecidos específicos, a compreensão dos mecanismos transcricionais que determinam sua expressão dirigida pode fornecer informações importantes a respeito de seu papel na célula. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi identificar e caracterizar a região promotora que regula a expressão do gene Rasgef1b em resposta à ativação de TLRs. Para isso, clonamos uma sequência de 2.8 kb (-2747/+119) a montante da região codificadora de Rasgef1b no plasmídeo repórter da luciferase pGL3-basic. Mutantes por deleções progressivas foram gerados e a atividade de cada construção foi avaliada através de estudos de transfecção transiente e ensaio de gene repórter. Nossos resultados mostram que uma curta sequência proximal contendo 302 pb (-183/+119) é suficiente e necessária para promover eficientemente a expressão da luciferase em células HEK293 e macrófagos Raw264.7, exibindo uma atividade basal robusta, mas também induzida por TLRs. Dessa forma, fornecemos evidências diretas que essa região é responsável pela atividade do promotor de Rasgef1b. Interessantemente, identificamos que a sequência é evolutivamente conservada, está contida em uma região de cromatina acessível, contém ilha CpG, parece recrutar constitutivamente a RNA Polimerase II, e abriga essencialemente elementos de ligação a Sp1 e ao principal fator de transcrição ativado por TLRs, o NF-kB. Mostramos que a superexpressão das subunidades de NF-kB RelA ou cRel, mas não os complexos de RelB, induzem a um aumento significativo na atividade do promotor, e que mutações nos sítios kB localizados a montante ou a jusante do TSS resultam em significativa redução de sua atividade induzida por LPS em macrófagos murinos. Além disso, demonstramos através de ensaios de mobilidade eletroforética (EMSA) que parte dos elementos kB são capazes de recrutar dímeros NF-kB, e através de ChIP-seq, observamos que RelA é recrutado não somente à região do promotor, mas também a regiões distais. Finalmente, encontramos que a expressão de Rasgef1b induzida por TLRs é reduzida em macrófagos desprovidos de RelA ou tratados com o inibidor farmacológico Bay11-7082 indicando que sua expressão é parcialmente dependente de NF-kB. Em conjunto, reportamos pela primeira vez a identificação e caracterização funcional do promotor Rasgef1b, e demonstramos a contribuição do NF-kB em sua expressão induzida por TLRs.