Caracterização funcional da região promotora do gene Rasgef1b e avaliação de componentes da via de sinalização de receptores do tipo toll (TLRs) sobre sua regulação

• Autor(a) principal: Felipe Batista Leão
• Data de Publicação: 2016
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFMG
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/1843/33881
• topic: Biologia Celular; Biologia Celular; Fatores ras de Troca de Nucleotídeo Guanina; Receptores Toll-Like

O fator de troca de nucleotídeos guanina, RasGEF1b, é codificado por um gene de expressão induzida em células do sistema imune inato em resposta à ativação de receptores do tipo Toll (TLRs). Um aumento em sua transcrição ocorre em macrófagos humanos e murinos estimulados com diferentes agonistas de TLRs, assim como em camundongos infectados com protozoários parasitas. Para melhor compreender seu papel durante esse processo, é importante que se investigue cada aspecto da regulação e funcionamento desse GEF. Atualmente, no entanto, os mecanismos moleculares responsáveis por sua regulação transcricional são ainda desconhecidos. Portanto, nesse trabalho caracterizamos uma região regulatória localizada a montante da sequência codificadora do gene Rasgef1b murino. Nossas análises in silico indicam que a região investigada abriga sítios de ligação para fatores de transcrição críticos na resposta imune como AP-1, C/EBP, Sp1, STAT1 e NF-B. Para investigar funcionalmente essa região, utilizamos DNA genômico obtido de camundongo C57BL/6 para amplificar e clonar no plasmídeo repórter da luciferase pGL3-basic um segmento de 2.886 pb, gerando a construção pGL3-2.8 kb. Esse segmento compreende 119 nucleotídeos a jusante e 2.747 nucleotídeos a montante do sítio de início da transcrição (TSS) putativo de Rasgef1b (-2.747/+119). A construção pGL3-2.8 kb, assim como mutantes gerados por deleção, foram transfectados em células humanas HEK293 e em macrófagos murinos Raw264.7 para avaliação, por ensaios de gene repórter, de sua atividade constitutiva e induzida após ativação das vias disparadas por TLRs e fatores de transcrição da família NF-κB. Nossos resultados indicam que os segmentos analisados, exceto aquele com deleção da região que abriga o TSS putativo (pGL3-Δ492), apresentam atividade constitutiva elevada quando comparada ao vetor pGL3-basic. Ademais, a ativação das vias de TLRs resultou em um aumento significativo dessa atividade tanto em células HEK293 quanto em macrófagos Raw264.7. Além disso, em estudos de superexpressão conduzidos em células HEK293, as subunidades de NF-κB, p65(RelA) ou c-Rel foram suficientes para induzir um aumento significativo da atividade dos segmentos analisados. Em conjunto, nossos resultados sugerem que a região analisada corresponde à região promotora de Rasgef1b e ainda que os fatores da família de transcrição NF-κB parecem exercer um papel na indução da expressão desse gene. Adicionalmente, fornecemos evidências experimentais confirmando a presença do TSS putativo no gene Rasgef1b através de nested RT-PCR, e, por PCR em tempo real, demonstramos que os níveis do mRNA de RasGEF1b em macrófagos murinos derivados de medula óssea (BMDMs) são dominantes em relação aos outros membros RasGEF1a e RasGEF1c