Caracterização molecular e celular da função da ribonuclease RRP44 de Trypanosoma brucei

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Cesaro, Giovanna
Data de Publicação: 2022
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFPR
Texto Completo: https://hdl.handle.net/1884/78406
Resumo: Orientadora: Profa. Dra. Beatriz Gomes Guimarães
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spelling Cesaro, GiovannaZanchin, Nilson Ivo ToninUniversidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica)Guimarães, Beatriz Gomes2022-09-21T19:10:09Z2022-09-21T19:10:09Z2022https://hdl.handle.net/1884/78406Orientadora: Profa. Dra. Beatriz Gomes GuimarãesCoorientador: Prof. Dr. Nilson Ivo Tonin ZanchinTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica). Defesa : Curitiba, 30/03/2022Inclui referências: p. 146-155Resumo: O estudo de protozoários da família Trypanosomatidae desperta bastante interesse, tanto por serem agentes etiológicos de doenças como a doença de Chagas, doença do sono e leishmaniose, quanto por apresentarem várias características celulares e moleculares únicas. Em particular, os tripanossomatídeos possuem mecanismos não canônicos de expressão gênica e processamento de RNA, como o processamento dos RNAs mensageiros e RNAs pequenos nucleolares (mRNA e snoRNA, respectivamente) por trans-splicing. Em relação à estrutura dos ribossomos, enquanto nos demais eucariotos a subunidade 60S é formada por três moléculas de RNA (5S, 5.8S e 25S/28S), em tripanossomatídeos a subunidade 60S contém oito RNAs, sendo que a molécula correspondente ao RNA de 25S/28S é dividida em seis segmentos. Tais diferenças indicam diferenças no processo de maturação do RNA ribossomal (rRNA), que é necessário para a excisão de sete sequências espaçadoras internas do precursor. Apesar do processo de maturação do rRNA ser um interessante tema de estudo em tripanossomatídeos, poucas endo- e exonucleases envolvidas neste processo foram identificadas e caracterizadas. Uma das ribonucleases envolvidas no processamento do rRNA é a Rrp44, também responsável pela degradação de mRNAs e RNA transportadores (tRNA) que são transcritos erroneamente. Rrp44 apresenta atividades endo- e exonucleolítica e pertence à família RNase II/RNB de exonucleases 3'-5'. O objetivo deste estudo foi a caracterização estrutural e funcional da ribonuclease RRP44 de Trypanosoma brucei. A proteína selvagem e quatro variantes, três contendo mutações nos sítios endo e exonucleolíticos (TbRRP44D140N, TbRRP44D511N, TbRRP44D140N/D511N) e outra, um mutante de deleção da região N-terminal contendo o domínio endonucleolítico PIN (TbRRP44-(delta) NPIN) foram expressas em Escherichia coli e purificadas por cromatografia. A estrutura cristalográfica da TbRRP44-(delta)NPIN foi determinada a 2,23 Å de resolução em complexo com um oligoribonucleotídeo, capturando um estado pós-clivagem do substrato. Análises estruturais mostraram que o domínio exonucleolítico da TbRRP44 possui a estrutura e o sítio catalítico conservados em relação aos outros membros da família RNase II/RNB, apresentando maior similaridade com a Rrp44 de Saccharomyces cerevisiae. Apesar desta similaridade, o fato do modelo cristalográfico de TbRRP44-(delta)NPIN representar a proteína em sua forma ativa, permitiu a descrição de detalhes adicionais do sítio ativo, como a localização do segundo íon Mg2+ envolvido na reação de clivagem do substrato. Ensaios in vitro de degradação de RNA mostraram que a TbRRP44 possui preferência por substratos ricos em uracila, sendo também capaz de degradar RNAs estruturados sem extremidade 3' livre. Os ensaios de degradação juntamente com os ensaios de desvio de mobilidade eletroforética mostraram que o domínio PIN é importante estruturalmente para interação com o substrato, principalmente no caso de RNAs estruturados. Os efeitos da depleção de RRP44 a nível celular e molecular foram analisados utilizando células knockdown de T. brucei para RRP44, geradas através do mecanismo de RNA de interferência (RNAi). As células foram analisadas utilizando-se a técnica de tomografia de raios X moles, que permite a obtenção de imagens tridimensionais a alta resolução. Tais análises mostraram diversas alterações celulares como o aumento de vacúolos de baixa absorção, alterações no núcleo, além do aumento do volume e quantidade dos acidocalcissomos e gotas lipídicas. Comparações dos efeitos do RNAi com os efeitos do tratamento com inibidores de vias específicas revelaram que o fenótipo decorrente da depleção de TbRRP44 assemelha-se aos observados pela inibição da síntese de rRNA e inibição da maturação do mRNA. O processamento do rRNA foi analisado por Northern blot, utilizando-se sondas para a detecção de regiões específicas dos espaçadores internos (ITSs). Na ausência da TbRRP44, as células de T. brucei apresentam acúmulo do precursor do rRNA que contém os rRNAs da subunidade maior do ribossomo, além de acúmulo do pre-rRNA de 7S, o qual não é processado corretamente para formação do rRNA 5.8S maduro.Abstract: The scientific interest on protozoa of the Trypanosomatidae family arises both from the fact that they are etiological agents of diseases such as Chagas disease, sleeping sickness, and leishmaniasis, and from their unique cellular and molecular features. As compared to other eukaryotes, trypanosomatids have non-canonical mechanisms of control of gene expression and RNA processing. With regard to the ribosome structure, while in the other eukaryotes the 60S subunit is formed by three RNA molecules (5S, 5.8S, and 25S / 28S), in trypanosomatids the 60S subunit contains eight RNAs, in which the molecule corresponding to the 25S / RNA 28S is divided into six segments. Such structural differences indicate differences in the maturation process of the ribosomal RNA (rRNA), during excision of the seven internal spacer sequences from the precursor. Although the rRNA maturation process is an interesting topic in trypanosomatids, few endo and exonucleases involved in this process have been identified and characterized. Rrp44 is a conserved ribonuclease involved in pre-rRNA processing. It acts also in the degradation of defective mRNAs and transfer RNAs (tRNAs). Rrp44 presents endo- and exonuclease activities and belongs to the RNase II/RNB family of 3'-5' exonucleases. The aim of this study is to perform structural and functional characterization of the ribonuclease RRP44 from Trypanosoma brucei. The wild type TbRRP44 and four variants, three of them containing catalytic site mutations (TbRRP44D140N, TbRRP44D511N, TbRRP44D140N/D511N), and a fourth one with deletion of the N-terminal and endonucleolytic (PIN) domain (TbRRP44-(delta)NPIN), were overexpressed in Escherichia coli and purified by chromatographic methods. The crystal structure of TbRRP44-(delta)NPIN was determined at 2.23 Å resolution in complex with an oligoribonucleotide, revealing a post cleavage state of the substrate. The structural analysis revealed conservation of both TbRRP44 overall structure and catalytic site relative to the other RNase II/RNB family members, especially to Saccharomyces cerevisiae Rrp44. Despite this similarity, the fact that the TbRRP44- (delta)NPIN crystallographic model shows an active state of the protein, allowed the description of additional details of the active site, such as the location of the second Mg2+ ion involved in the substrate cleavage reaction. In vitro RNA degradation assays showed that TbRRP44 has higher activity on uracil-rich substrates, being also able to degrade structured RNAs lacking 3'-end overhang. The RNA degradation assays together with electrophoretic mobility shift assays showed that the physical presence of the PIN domain is important for interaction with the substrate, especially in the case of structured RNAs. Analyses of the effects of RRP44 depletion at the cellular and molecular level were performed using a T. brucei strain genetically modified for conditional knockdown of the RRP44 protein, using the RNA interference mechanism. The cells were analyzed using the soft X-ray tomography, which allows for reconstruction of high-resolution three-dimensional images. These analyses revealed several cellular alterations such as increase of low absorption vacuoles that occupy a large volume of the cytoplasm, nucleus alteration, in addition to the increase in the volume and quantity of acidocalcysomes and lipid droplets. Comparisons between the effects of RNAi and treatments with inhibitors of specific pathways revealed that the phenotype resulting from TbRRP44 depletion resembles those observed by inhibition of rRNA transcription and mRNA maturation. Processing of the rRNA was analyzed by Northern blot, using probes complementary to specific regions of the internal transcribed spacers (ITSs). In the absence of TbRRP44, T. brucei cells showed accumulation of the largest rRNA precursor of the large ribosomal subunit of the ribosome, in addition to accumulation of the 7S pre-rRNA which is not properly processed for formation of the 5.8S mature rRNA.1 recurso online : PDF.application/pdfRibonucleasesTrypanosoma bruceiMaturaçãoTomografiaCristalografiaRaioBioquímicaCaracterização molecular e celular da função da ribonuclease RRP44 de Trypanosoma bruceiinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALR - T - GIOVANNA CESARO.pdfapplication/pdf13717287https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/78406/1/R%20-%20T%20-%20GIOVANNA%20CESARO.pdf930c5ca5e6768de899a04b211fe301d7MD51open access1884/784062022-09-21 16:10:09.999open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/78406Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082022-09-21T19:10:09Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false
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