Caracterização estrutural e da interação com DNA do domínio cold-shock da proteína AtGRP2 de Arabidopsis thaliana por ressonância magnética nuclear

• Autor(a) principal: Pougy, Karina de Carvalho
• Data de Publicação: 2021
• Tipo de documento: Trabalho de conclusão de curso
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFRJ
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/11422/20879
• topic: AtGRP2; Proteínas; DNA; Ressonância Magnética Nuclear; CNPQ::CIENCIAS EXATAS E DA TERRA::QUIMICA

AtGRP2 (Arabidopsis thaliana glycine rich protein 2) é uma proteína rica em glicina e ligante de RNA que desempenha papéis chave na resposta a estresse abiótico e na regulação do tempo de floração em Arabidopsis thaliana. Esta proteína contém um domínio N-terminal coldshock (CSD) e dois domínios C-terminais zinc finger do tipo CCHC retrovirais intercalados com regiões ricas em glicinas. Domínios cold-shock são conhecidos por se ligarem a ácidos nucleicos. Dada a função de AtGRP2 na tolerância a estresses abióticos em A. thaliana, o conhecimento de seu mecanismo de ação se faz interessante dentro do contexto de poluição ambiental e aquecimento global. Assim, o presente projeto teve como objetivo a caracterização estrutural e análise da interação com o oligonucleotídeo T7 do CSD de AtGRP2 de modo a se iniciar o processo de elucidação do mecanismo de ação da proteína a nível atômico. Uma construção do CSD de AtGRP2 (aminoácidos 1-79) foi expressa de forma recombinante em cepas de E. coli, BL21 (DE3), e purificada através de uma combinação de técnicas cromatográficas (cromatografia por afinidade a níquel e cromatografia por exclusão molecular). No espectro 2D [ 1H,15N] HSQC de AtGRP2-CSD foi constatada a presença de mais do que o dobro da quantidade de sinais esperados; estes sinais extras são caracterizados por uma baixa dispersão na dimensão do 1H, encontrados aglomerados em torno de 8,2 ppm, e maior intensidade. Foi concluído que há uma conformação desenovelada em equilíbrio com o estado enovelado da proteína em solução. A partir dos experimentos de RMN multidimensional adquiridos, foi possível assinalar 95% das ressonâncias da forma enovelada de AtGRP2-CSD, com exceção dos 2 artifícios de clonagem e dos resíduos M1 e S41, e 68% da forma desenovelada, sendo os seguintes aminoácidos não identificados: G-1, H0, M1, S2, N5, R10, S14, V15, K16, W17, F18, D19, T20, Q21, K22, G23, F24, D30, D31, H39, Q40, S41, L51, A52 e N65. Este equilíbrio conformacional já foi observado na literatura para as proteínas drkN SH3 e YB-1 CSD. O propósito desta instabilidade parcial e sua função no mecanismo de ação destas proteínas e de AtGRP2-CSD ainda deve ser mais investigado. A análise da interação de AtGRP2-CSD com o oligonucleotídeo T7 foi realizada através de experimentos de titulação por RMN em razões molares crescentes de ligante e a Perturbação do Deslocamento Químico (CSP) foi calculada a partir destes. A superfície de interação proteína-DNA foi identificada a partir de resíduos com valores de CSP maiores que 2 e 3σ: G25, F26, L36 e V38 (3σ) e G23, T28, F37, H39, Q40, R49 e L51 (2σ). Estes fazem parte dos motivos ligantes de ácidos nucleicos RNP-1 e RNP-2 de AtGRP2-CSD e da região de loop β3β4, a qual é conhecida na literatura por auxiliar na interação entre CSDs e ácidos nucleicos.