Plasmídeos calibrantes para quantificação evento-específica de feijão GM e detecção de feijão após tratamento térmico por qPCR

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Venturelli, Gustavo Luiz
Data de Publicação: 2018
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFSC
Texto Completo: https://repositorio.ufsc.br/handle/123456789/206090
Resumo: Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos, Florianópolis, 2018.
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spelling Plasmídeos calibrantes para quantificação evento-específica de feijão GM e detecção de feijão após tratamento térmico por qPCRCiência dos alimentosFeijãoAlimentos geneticamente modificadosPlasmideosTese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos, Florianópolis, 2018.O feijão é uma das leguminosas mais consumidas no mundo e possui grande importância socioeconômica em países pouco desenvolvidos. No Brasil, faz parte da alimentação diária de mais da metade da população. Além de grande consumidor, o Brasil também é um dos maiores produtores de feijão, porém devido as grandes perdas nas lavouras, a Embrapa desenvolveu o feijoeiro geneticamente modificado Embrapa 5.1, que apresenta resistência ao vírus do mosaico dourado. O objetivo deste trabalho foi desenvolver plasmídeos calibrantes para ensaios qPCR espécie-específico LEC (ensaio de referência endógena que tem como alvo o gene da lectina) e evento-específico FGM (ensaio evento-específico que visa a junção entre o inserto 5.1 e região genômica do feijão) de detecção e quantificação do feijão Embrapa 5.1 em alimentos e avaliar a aplicabilidade destes ensaios em grãos de feijão que sofreram tratamento térmico. Uma nova referência endógena, denominada de ensaio FAS (ensaio de referência endógena com alvo no gene da a-faseolina), foi testada e uma alta especificidade para as amostras do gênero Phaseolus foi observada, sendo então este ensaio estabelecido como gênero-específico. Diferentemente, o ensaio LEC apresentou alta especificidade apenas para as amostras da espécie Phaseolus vulgaris. Amostras de feijão foram tratadas termicamente em autoclave e testadas com os ensaios FAS, LEC e FGM. Dois protocolos de extração de DNA foram testados, e os melhores resultados de Cq foram observados nas amostras extraídas com o protocolo modificado. Apesar da degradação observada no DNA após o processamento, todos os ensaios foram capazes de detectar a presença de DNA. Amostras de DNA de feijão GM foram misturadas com amostras de DNA de feijão não-GM, o ensaio FGM obteve uma eficiência média de 92% e foi capaz de detectar uma quantidade de DNA de feijão GM referente a 0,39% do DNA total. Por sua vez, o ensaio LEC detectou a presença de DNA em 98,3% das reações e apresentou uma elevada estabilidade entre as amostras. Os plasmídeos calibrantes pLEC e pFGM foram desenvolvidos, ambos apresentaram eficiência média entre o limite de 90-110% para dois operadores e dois protocolos de extração de DNA e também em duplex qPCR. Este trabalho confirmou a aplicabilidade dos métodos desenvolvidos como ferramentas eficientes na detecção e quantificação do feijão GM Embrapa 5.1 em alimento após tratamento térmico.Abstract : The common bean is one of the most consumed legumes in the world and have great socioeconomic importance in less developed countries. In Brazil, it is part of the daily diet of more than half the population. In addition to being a major consumer, Brazil is also one of the largest producers of common bean, but due to large crop losses, Embrapa has developed the genetically modified Embrapa 5.1 bean, which is resistant to the golden mosaic virus. The aim of this work was to develop plasmid calibrators qPCR assays for species-specific LEC (endogenous reference assay targeting the lectin gene) and event-specific FGM (event-specific assay targeting the junction between the 5.1 insert and genomic region of the common bean) detection and quantification of Embrapa 5.1 common bean in foods and to evaluate the applicability of these assays to heat-treated bean grains. A new endogenous reference, called the FAS assay (endogenous reference assay targeting the a-faseolin gene), was tested with 70 different samples, including bean cultivars and other species. A high specificity for the samples of the genus Phaseolus was observed, and this assay was established as genus-specific. Differently, the LEC assay showed high specificity only for samples of the species Phaseolus vulgaris. Bean samples were heat-treated in autoclave and tested with the FAS, LEC and FGM assays. Two DNA extraction protocols were tested, and the best Cq results were observed in the samples extracted with the modified protocol. Despite degradation observed in the DNA after processing, all assays were able to detect the presence of DNA. GM bean DNA samples were mixed with non-GM bean DNA samples, the FGM assay obtained a mean efficiency of 92% and was able to detect an amount of GM bean DNA relative to 0.39% of the total DNA. In turn, the LEC assay detected the presence of DNA in 98.3% of the reactions and showed a high stability between the samples. The plasmid calibrators pLEC and pFGM were developed, both presented average efficiency between the limit of 90-110% for two operators and two protocols of DNA extraction and also in duplex qPCR. This work confirmed the applicability of the methods developed as efficient tools in the detection and quantification of GM Embrapa 5.1 beans in food after heat treatment.Arisi, Ana Carolina MaisonnaveUniversidade Federal de Santa CatarinaVenturelli, Gustavo Luiz2020-03-31T14:44:57Z2020-03-31T14:44:57Z2018info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesis99 p.| il., gráfs., tabs.application/pdf360376https://repositorio.ufsc.br/handle/123456789/206090porreponame:Repositório Institucional da UFSCinstname:Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)instacron:UFSCinfo:eu-repo/semantics/openAccess2020-03-31T14:44:57Zoai:repositorio.ufsc.br:123456789/206090Repositório InstitucionalPUBhttp://150.162.242.35/oai/requestopendoar:23732020-03-31T14:44:57Repositório Institucional da UFSC - Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)false
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