Produção e purificação de L-Asparaginase por fungos filamentosos isolados do Cerrado do Centro-Oeste brasileiro

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Freitas, Marcela Medeiros de
Data de Publicação: 2020
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
eng
Título da fonte: Repositório Institucional da UnB
Texto Completo: http://repositorio2.unb.br/jspui/handle/10482/47915
Resumo: Tese (doutorado) — Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2020.
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spelling Produção e purificação de L-Asparaginase por fungos filamentosos isolados do Cerrado do Centro-Oeste brasileiroProduction and purification of L-asparaginase by filamentous fungi isolated from the Brazilian Midwestern CerradoL-AsparaginaseFungosCerradosLeucemia linfoblástica aguda (LLA)Tese (doutorado) — Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2020.L-asparaginase (ANSase) é uma importante enzima na área farmacêutica utilizada no tratamento da leucemia linfoblástica aguda (LLA) devido à sua capacidade de hidrolisar a L-asparagina, um aminoácido não-essencial sintetizado por células normais, ao contrário das células neoplásicas. Os efeitos adversos das formulações de ASNase estão associados à imunogenicidade da enzima, seus resíduos após hidrólise por proteases, coatividade de glutaminase (GLNase), neurotoxicidade da amônia e sua origem bacteriana, portanto, é importante encontrar novas fontes de microrganismos eucarióticos produtores de ASNase com baixa atividade GLNase. Este trabalho avaliou o potencial biotecnológico de fungos filamentosos isolados de solo e plantas do Cerrado do Centro-Oeste brasileiro para a produção de ASNase. Quarenta isolados foram selecionados para triagem da produção de enzima, dentre os quais três isolados do solo apresentaram altos teores de atividade da ASNase com baixos valores de atividade da GLNase: Penicillium sizovae, Penicillium cerradense e Fusarium proliferatum. A triagem das variáveis que influenciam a produção de ASNase avaliadas por Plackett-Burman Design revelou que produção da enzima de P. sizovae foi reprimida por fontes de carbono, enquanto concentrações mais altas de carbono aumentaram a produção por F. proliferatum. Quanto à extração da proteína, a maceração da biomassa congelada liberou 5 vezes mais enzima das células do que a sonicação. A ASNase de P. sizovae foi parcialmente purificada por cromatografia de gel filtração seguida de troca iônica. A sequência da ASNase de P. sizovae foi identificada (massa molecular 160 kDa), sintetizada nas formas nativa e parcial (exclusão do peptídeo sinal) e expressa em Komagataella phaffii X-33 com vetor pPICZαA, onde sua atividade biológica foi preservada intracelularmente. Este é o primeiro estudo que expressa a ASNase de um fungo filamentoso em uma levedura. Este estudo mostra o potencial dos fungos do Cerrado brasileiro como novas fontes de ASNase com uma possível redução dos efeitos colaterais para a terapia de LLA.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).L-asparaginase (ANSase) is an important enzyme in the pharmaceutical field used in the treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL) due to its ability to hydrolyze L-asparagine, a non-essential amino acid synthesized by normal cells, unlike neoplastic cells. The adverse effects of ASNase formulations are associated with the immunogenicity of the enzyme, its residues after hydrolysis by proteases, glutaminase (GLNase) coactivity, ammonia neurotoxicity and its bacterial origin, therefore, it is important to find new sources of eukaryotic microorganisms producing ASNase with low GLNase activity. This work evaluated the biotechnological potential of filamentous fungi isolated from soil and plants of the the Brazilian Midwest Savanna for the production of ASNase. Forty isolates were selected for screening of enzyme production, among which three isolates from the soil showed high levels of ASNase activity with low values of GLNase activity: Penicillium sizovae, Penicillium cerradense and Fusarium proliferatum. The screening of variables that influence ASNase production evaluated by Plackett-Burman Design revealed that production of the P. sizovae enzyme was suppressed by carbon sources, while higher concentrations of carbon increased production by F. proliferatum. As for protein extraction, the maceration of frozen biomass released 5 times more enzyme from the cells than sonication. P. sizovae ASNase was partially purified by gel filtration chromatography followed by ion exchange. The sequence of P. sizovae ASNase was identified (molecular mass 160 kDa), synthesized in native and partial forms (exclusion of the signal peptide) and expressed in Komagataella phaffii X-33 with vector pPICZαA, where its biological activity was preserved intracellularly. This is the first study that expresses the ASNase of a filamentous fungus in a yeast. This study shows the potential of fungi from the Brazilian Cerrado as new sources of ASNase with a possible reduction of side effects for ALL therapy.Faculdade de Ciências da Saúde (FS)Departamento de Farmácia (FS FAR)Programa de Pós-Graduação em Ciências FarmacêuticasBatista, Pérola de Oliveira Magalhães Diasmarcelamdf1@gmail.comFreitas, Marcela Medeiros de2024-02-27T20:26:53Z2024-02-27T20:26:53Z2024-02-272020-12-14info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfFREITAS, Marcela Medeiros de. Produção e purificação de L-Asparaginase por fungos filamentosos isolados do Cerrado do Centro-Oeste brasileiro. 2020. 265 f., il. Tese (Doutorado em Ciências Farmacêuticas) — Universidade de Brasília, Brasília, 2020.http://repositorio2.unb.br/jspui/handle/10482/47915porenginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNB2024-02-27T20:26:54Zoai:repositorio.unb.br:10482/47915Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2024-02-27T20:26:54Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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