Estudo dos genes RHD-CE híbridos em pacientes com anemia falciforme e doadores de sangue

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Vendrame, Tatiane Aparecida de Paula, 1986-
Data de Publicação: 2022
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/6410
Resumo: Orientador: Lilian Maria de Castilho
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No presente estudo, genes RH híbridos foram investigados usando o método Quantitative Multiplex Polymerase Chain Reaction of Short Fluorescent Fragments (QMPSF), um protocolo molecular que quantifica o número de cópias de exons dos genes RHD e RHCE. Além disso, exploramos informações relevantes adicionais obtidas com a utilização de QMPSF, como o reconhecimento de variantes RHCE e a determinação da zigosidade RHD. Método: Três grupos foram selecionados para o estudo: pacientes com AF, doadores autodeclarados afrodescendentes (ADA) e doadores fenotipados como RhD-negativo (DN). Os genes híbridos RHD e RHCE foram investigados pelo método QMPSF, além disso foi utilizado o ensaio de PCR multiplex em tempo real para confirmar o número de cópias do gene RHD. A clonagem foi realizada para caracterizar um novo alelo encontrado, no qual um paciente com genótipo RHCE*cE/RHCE*ce apresentou a variação de um único nucleotídeo (SNV) c.916A>G. A densidade antigênica do antígeno RhD foi investigada por citometria de fluxo e a fenotipagem RhCE foi realizada em microplaca e gel teste. Resultados: Foram analisados um total de 507 amostras, a frequência dos alelos RH híbridos foi de 20.08% em pacientes com AF, 18,22% nos doadores ADA e 3.67% em doadores D-negativos. Os grupos AF e ADA apresentaram maior frequência de alelos híbridos, mais comumente envolvendo o exon 8, onde encontramos associação com o SNV c.733C>G, polimorfismo comum observado em indivíduos afrodescendentes com variantes RHCE. Curiosamente, dois pacientes com AF apresentaram três cópias do gene RHD, confirmado por PCR em tempo real, mas não foi observado aumento na expressão do antígeno D nesses pacientes. Além disso, o método QMPSF proporcionou a investigação de 144 variantes RHCE, a determinação da zigosidade RHD e a identificação de dois novos alelos. Conclusão: QMPSF mostrou-se relevante para identificar alelos híbridos envolvidos em fenótipos Rh alterados em doadores de sangue e pacientes com AF. A associação encontrada do alelo híbrido RHCE-D(8)-CE com c.733C>G indica que este alelo híbrido pode ser utilizado como marcador para detecção das variantes RHCE mais frequentes encontradas em pacientes com AFAbstract: Background: Hybrid genes are responsible for Rh variants formation and common in patients with sickle cell disease (SCD). However, their detection is often not possible by conventional molecular protocols. In the present study, hybrid genes were investigated by using the Quantitative Multiplex Polymerase chain reaction of Short Fluorescent Fragments (QMPSF), a molecular protocol that quantifies the copy number of RHD and RHCE exons. In addition, we explored additional relevant information obtained with QMPSF, such as recognition of variant RHCE and RHD zygosity. Method: Three groups were selected for the study: patients with SCD, self-declared African descent donors (SDA) and D-negative donors. RHD and RHCE hybrids genes were investigated by the QMPSF method. Real-time multiplex PCR assay was used to confirm the copy number of the RHD. Cloning was performed for investigating of allele. Relative RhD antigen density was investigated by flow cytometry and RhCE phenotyping was performed in microplate and gel test. Results: In a total of 507 samples analyzed, hybrid allele frequencies were 20.08% in patients with SCD, 18,22% in individuals from SDA group and 3.67% of D-negative donors. The SCD and SDA groups had a higher frequency of hybrid alleles, most commonly involving exon 8, which we found an association with c.733C>G, a common polymorphism observed in Afro-descendent individuals. Of note, two patients with SCD were shown to carry three gene copies, as confirmed by quantitative PCR. No increase in D expression was observed in these patients. Additionally, the QMPSF guided the investigation of 144 RHCE variants and RHD zygosity and two novel alleles were identified. Conclusion: The QMPSF was shown to be relevant to identify hybrid alleles involved in altered Rh phenotypes in African Brazilian donors and patients with SCD. The association of the hybrid RHCE-D(8)-CE allele with c.733C>G allow this hybrid allele may be used as a marker to detection of the most frequent variants found in patients with SCDDoutoradoClínica MédicaDoutora em Ciências[s.n.]Castilho, Lilian Maria deGilli, Simone Cristina OlensckiBenites, Bruno DeltreggiaSandoval, Evandra Strazza RodriguesSippert, Emilia ÂngelaUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Ciências MédicasPrograma de Pós-Graduação em Clínica MédicaUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASVendrame, Tatiane Aparecida de Paula, 1986-20222022-08-30T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf1 recurso online (84 p.) : il., digital, arquivo PDF.https://hdl.handle.net/20.500.12733/6410VENDRAME, Tatiane Aparecida de Paula. Estudo dos genes RHD-CE híbridos em pacientes com anemia falciforme e doadores de sangue. 2022. 1 recurso online (84 p.) Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/6410. 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